小鼠胚胎皮肤和Live成像黑素细胞迁移的体外培养
Summary
我们描述了小鼠胚胎皮肤的解剖和体外培养。培养系统保持一个气 – 液界面在整个组织表面，并允许成像于倒置显微镜。黑素细胞中，显影皮肤的成分，被荧光标记的允许使用共聚焦显微镜观察其行为。
Abstract
黑素细胞是黑素细胞衍生的前体神经嵴;细胞负责产生色素在皮肤和头发。黑素细胞经过胚胎，他们随后殖民开发毛囊1,2的表皮迁移。神经嵴细胞的迁移是广泛的研究在体外 ，但体内的方法仍然没有得到很好的发展，特别是在哺乳动物系统。一种替代方法是使用体外器官型培养3-6。小鼠胚胎皮肤培养需要一个气-液界面（ALI）的跨组织3,6的表面的维护。高分辨率实时成像的小鼠胚胎的皮肤已经受到阻碍，缺乏一个很好的方法，它不仅保持了这个ALI的也可以让文化被倒置，因此，短工作距离物镜，最共聚焦显微镜兼容的。本文介绍了最新改进的甲基OD使用的气体透过膜，以克服这些问题，并允许胚胎皮肤中体外培养6的高分辨率共焦成像。通过使用黑素细胞特异性表达Cre重组酶表达小鼠线结合R26YFPR记者一行，我们能够这些皮肤文化中，以荧光标记的黑素细胞的人口。该技术允许实时成像黑素细胞，并观察他们的行为，并与他们发展组织的相互作用。代表性的成果包括以展示能力，生活图像6文化并行。
Introduction
传统胚胎皮肤已经培养了来自小鼠胚胎解剖和安装在聚碳酸酯核孔膜。然后将膜漂浮在培养基中，从而保持一个气-液界面在发展中国家组织3,4的表面上。这一技术已被用于固定组织，并评估用β-半乳糖苷酶作为标记7黑素细胞分布测定黑素细胞的行为。我们已经开发出一种方法，可以让在体外培养皮肤的6个现场成像的荧光标记的黑素细胞。在这里，我们描述的方法在细节上剥离，设置，住聚焦成像，其中包括最近的一些改进。
黑素细胞是黑素细胞的胚胎前体，产生色素在头发和皮肤细胞。黑素细胞起源在邻近神经管的神经嵴在胚胎周围每天9（E9）在发育中的小鼠émbryo。随后，他们沿着外胚层和开发体节之间的背侧途径迁移。在E12.5他们从真皮层移动到它们增殖并继续他们的迁移表皮。初级毛囊格局开始形成本地化是这些毛囊在表皮在E14.5和E15.5黑素细胞。对于黑素细胞/黑素细胞发展的综述参见托马斯＆埃里克森（2008年）1。以标签的黑素细胞的人口，我们结合酪氨酸::动物CREB表达Cre重组酶的小鼠酪氨酸酶启动子8与R26YFPR动物表达黄色荧光蛋白（YFP）有条件地从ROSA26轨迹9驱动。
我们描述的方法来使用倒置共聚焦显微镜培养胚胎皮肤和采集图像。它适于形式在莫特等人描述的原始方法（2010）6。本方法使成像在6孔格式和消除了对核孔膜和基质胶上的依赖，以支持培养。代替用1％琼脂糖的一个小块，以稳定胚胎皮肤。去除基质胶上的依赖是很重要的特别是当胚胎皮肤的可溶性生长因子的响应是研究的重点。我们原来的方法已经被用来获得新的见解黑素细胞发展10-13和我们预期，我们在这里描述的改进将使其更加强大的实验技术特别是在多个并行的文化是一个要求。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们描述一个方法来培养胚胎的皮肤是特殊性服从活细胞成像的共聚焦倒置显微镜。该方法包括近期的改进，允许6文化进行成像的并行和消除了对基质胶与原方法的6核孔膜的依赖。从类似的技术的关键技术的区别在于使用具有透气性的lummox膜的建立空气液体界面并且还充当盖玻片。我们已经成功地保持了连续的共焦成像的培养长达48小时。高分辨率和出色的信号发送到共焦图象的信噪比?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由医学研究委员会的核心资金支持。我们感谢克雷格·尼科尔编制技术图纸。我们感谢马修·皮尔逊和保罗·佩里为他们的影像支持。
Materials
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
Referenzen
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