بروتوكول لتحليل التهاب الكبد الوبائي فيروس النسخ المتماثل
Summary
Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.
Abstract
التهاب الكبد C فيروس (HCV) يؤثر على 3٪ من سكان العالم ويسبب أمراض خطيرة في الكبد بما في ذلك التهاب الكبد المزمن، تليف الكبد، وسرطان الكبد. سي هو فيروس الحمض النووي الريبي يلفها ينتمون إلى عائلة الفيروسات المصفرة. العلاج الحالية ليست فعالة تماما ويسبب آثار جانبية ضارة. لا يوجد لقاح التهاب الكبد الوبائي المتاحة. وبالتالي، مطلوب جهد استمر لتطوير لقاح وعلاج أفضل. خلية نظام الثقافة HCV أمر بالغ الأهمية لدراسة مختلف مراحل النمو بما في ذلك دخول الفيروس HCV، وتكرار الجينوم، والتغليف، والخروج. في الإجراء الحالي قدم، كنا فيروس من النوع البري intragenotype 2A خيالية، FNX-HCV، والمؤتلف فيروس FNX-Rluc يحمل Renilla luciferase المراسل مراسل الجينات لدراسة تكاثر الفيروس. خط الخلية الكبدي الإنسان كان يستخدم لترنسفكأيشن في المختبر (7 هوه القائم) كتب HCV الرنا الجيني. supernatants ثقافة خالية من الخلايا، لست] البروتين ورتم حصادها RNA OTAL في وقت مختلف النقاط بعد ترنسفكأيشن لتقييم النمو HCV. تم تقييم HCV الجينوم حالة النسخ المتماثل التي كتبها الكمي RT-PCR وتصور وجود HCV RNA المزدوج تقطعت بهم السبل. تم التحقق من التعبير البروتين HCV بواسطة وصمة عار والمقايسات المناعي الغربية باستخدام الأجسام المضادة المحددة لHCV NS3 وNS5A البروتينات. وقد تم قياس الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل HCV RNA صدر الجسيمات المعدية في طاف الثقافة وعيار الفيروسية. واستخدمت المقايسات luciferase المراسل لتقييم مستوى التكرار والعدوى مراسل سي. في الختام، فإننا نقدم مختلف المقايسات الفيروسية لوصف المراحل المختلفة من دورة النسخ المتماثل HCV.
Introduction
التهاب الكبد الوبائي (HCV) يسبب تليف الكبد وسرطان الكبد. فإنه يؤثر على 170 مليون شخص في جميع أنحاء العالم مع 350،000 شخص يموتون سنويا 1-3. HCV هو حبلا إيجابية فيروس الحمض النووي الريبي مع حجم الجينوم من 9.6 كيلو بايت. تتم ترجمة الجينوم HCV باعتبارها واحدة من polyprotein ~ 3،000 الأمينية بقايا حمض التي المشقوق proteolytically من قبل مختلف البروتياز الخلوية والفيروسية في 10 البروتينية. سي هو فيروس النموذج في جنس Hepacivirus وينتمي إلى عائلة الفيروسات المصفرة 4. عند التعرض، HCV يحدد عدوى مزمنة في 80٪ من الأفراد. العدوى بدون أعراض في الغالب والتشخيص في الوقت المناسب يمكن أن تسمح التدخل العلاجي لمنع تدهور الكبد. العلاج الحالي هو الأمثل وأي لقاح متاح 5،6.
وكان أول وصف مسببات التهاب الكبد C في عام 1989 7. دراسة النسخ المتماثل HCV المهم لقاح التهاب الكبد C والبحوث العلاج، ولكن كان عليهأعاق طويلة من عدم وجود نظام الثقافة الفيروسية كفاءة. وقد أظهرت استنساخ الجزيئي للفيروس (سي) لتكون معدية في الشمبانزي على التلقيح داخل الكبد 8. في وقت لاحق، وصفت replicons HCV الفرعية الجيني، مما سمح لتشريح الفيروسية مرحلة تكرار الجينوم في 9،10 نظام خلية ثقافة. اكتشاف HCV الوراثي 2A عزل JFH-1 (اليابانية التهاب الكبد مداهم-1)، القادرة على إصابة خلية ثقافة فتحت آفاقا جديدة للبحث تكرار HCV 11-13. سلالة النمط الجيني 2A JFH-1 استنادا الفيروسات خيالية بين وداخل الوراثي والنمط الجيني 1 HCV هي أنظمة الثقافة المعدية استنادا المتاحة، فضلا 14-18.
وقد استخدمنا بنجاح JFH-1 سلالة وHCV intragenotype 2A الفيروس خيالية للحصول على دقة عالية خارطة التنميط وظيفية من المجالات البروتين ورابطة الدول المستقلة المفعول عناصر الحمض النووي الريبي 19،20. وفقا لهذا، ونحن هنا تصف نظام الثقافة فعالة تستخدم بشكل روتيني أن يسمحدراسة مراحل مختلفة من دورة النسخ المتماثل HCV والتفاعل المضيف الممرض. نقدم فحوصات الفيروسية لتقييم تكرار الجينوم الفيروسي والعدوى نوفو دي من intragenotype 2A سي ومراسل سي Renilla luciferase المراسل القائمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا التوضيح طريقة لتحليل دورة النسخ المتماثل فيروس التهاب الكبد الوبائي. HCV هو الممرض الإنسان وسوف بروتوكول السلامة الأحيائية وصفه يجب اتباعها بدقة. وقد وصفت نظم زراعة الخلايا HCV المعدية سابقا 11-13،16،17. هناك عدد قليل من النقاط الحاسمة عندما ننفذ بعد بروتوكول…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
Referenzen
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
- Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
- Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. . Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , 1101-1152 (2007).
- Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
- Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
- Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
- Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
- Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
- Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
- Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
- Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
- Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
- Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
- Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
- Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
- Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
- Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
- Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
- Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
- Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
- Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
- Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
- Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).
