Visualização de endosome Dynamics em Viver terminais nervosos com quatro-dimensional imagens de fluorescência
Summary
Quadridimensional (4D) de imagem é utilizada para estudar o comportamento e as interacções entre os dois tipos de endossomas em terminais nervosos vertebrado vivo. O movimento destas pequenas estruturas é caracterizado em três dimensões, permitindo a confirmação de eventos, tais como a fusão do endossoma e exocitose.
Abstract
Quadridimensional (4D) Luz de imagem tem sido usada para estudar o comportamento de pequenas estruturas dentro de terminais nervosos do motor do transverso abdominal muscular magra da cobrinha. Os dados brutos compreende as sequências de lapso de tempo de z-stacks 3D. Cada pilha contém 4-20 imagens adquiridas com óptica de epifluorescência a planos focais separados por 400-1,500 nm. Etapas na aquisição de pilhas de imagens, tais como o ajuste de foco, de comutação de comprimentos de onda de excitação, e o funcionamento da câmara digital, são automatizados, tanto quanto possível para maximizar a taxa de imagem e para minimizar danos nos tecidos da exposição à luz. Após aquisição, um conjunto de pilhas de imagens é deconvolved para melhorar a resolução espacial, convertido para o formato 3D desejado, e utilizado para criar um 4D "filme" que é adequado para diversas análises baseadas em computador, dependendo dos dados experimentais pretendidos. Uma aplicação é o estudo do comportamento dinâmico de duas classes de endosomes encontrados em terminais nervosos-macroendosomes (MES)e endossomas ácidas (AEs), cujos tamanhos (200-800 nm para ambos os tipos) estão em ou próximo do limite de difracção. O acesso à informação 3D em cada momento fornece várias vantagens sobre imagens de lapso de tempo convencional. Em particular, o tamanho e a velocidade de movimento das estruturas podem ser quantificados ao longo do tempo sem perda de foco. Exemplos de dados de imagens 4D revelam que MEs aproximar da membrana plasmática e desaparecem, o que sugere que eles são exocytosed em vez de um simples movimento, afastado verticalmente, a partir de um único plano de foco. Também é revelado fusão putativo de MEs e AES, através da visualização de sobreposição entre as duas estruturas que contêm corante como visto em cada três projeções ortogonais.
Introduction
Time-lapse de imagem de tecidos vivos proporciona acesso visual para as relações estrutura-função dinâmicos que não podem ser apreciados em preparações que vivem fixos ou fotografada em um único ponto no tempo. Muitas vezes, no entanto, a desvantagem de acesso a informação temporal é uma redução na resolução óptica. Objetivos de imersão em óleo alta abertura numérica são impraticáveis em tecidos vivos por causa de sua estreita faixa de foco, deixando de imersão em água ou objetivos secos como as únicas alternativas. Além disso, o aumento da resolução proporcionada pelo óptica confocal não pode ser utilizado em algumas preparações de vida devido a fototoxicidade dos níveis relativamente elevados de iluminação necessárias 1,2. Por fim, enquanto várias técnicas ópticas em tempo real ou time-lapse estão disponíveis que oferecem uma melhor resolução, a sua aplicabilidade é limitada às preparações onde as estruturas de interesse podem ser posicionados dentro de algumas centenas de nanômetros do objectivo 1. O método descritofaz uso de equipamentos de custo relativamente baixo, é versátil, mas oferece melhor resolução em comparação com técnicas de lapso de tempo mais comumente usados. Ele é destinado para uso em laboratórios individuais, bem como instalações de imagem.
O método utiliza microscopia de epifluorescência convencional, combinado com uma câmera digital sensível e com hardware projetado para adquirir rapidamente conjuntos de imagens a um nível ligeiramente diferentes planos focais (Z-pilhas). Cada pilha z digitalmente é deconvolved para aumentar a resolução. Uma característica do 3D time-lapse (4D) de imagem é o acompanhamento preciso das organelas ou outras estruturas em movimento. Quando configurado corretamente, as estruturas fotografadas não saem de foco, eo movimento em todas as três direções podem ser observados e quantificados. Assim, é impossível para uma estrutura manchado a desaparecer em um ou mais quadros de lapso de tempo apenas por deriva acima ou abaixo de um plano focal estreita. O método também serve como uma ferramenta sensível para avaliar as interações e possíveis fução de pequenas estruturas. Epifluorescência Convencional ou imagens confocal de estruturas perto do limite de difração (algumas centenas de nm) não confirmam fusão mesmo que as imagens fundidas mostram sobreposição das respectivas etiquetas 3. Fusão é sugerida, mas permanece a possibilidade de que os objectos estão separados horizontalmente ou verticalmente por uma distância que é inferior ao limite de difracção. Três ou quatro imagiologia tridimensional, em contraste, permite a visualização dos objectos em cada uma de três direcções ortogonais. O aparecimento de fusão em todos os três pontos de vista aumenta o nível de segurança. E, em algumas preparações de vida, dirigido ou movimento browniano de objetos supostamente fundidos fornece mais uma prova quando ambos os rótulos se movem juntos no tempo. Claro que, quando perto do limite de difração o nível de certeza em estruturas mais exigentes de fundo, ou mostrando que eles contêm dois corantes (fusão), não é absoluta. Se aplicável, técnicas especializadas, tais como a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET)4, são mais apropriadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O aspecto mais crítico de 4D de imagem é a gestão da duração e intensidade da exposição à luz. Fotodegradação diminui imagem relação sinal-ruído e pode ser problemático ou não, dependendo de vários fatores, incluindo a escolha de fluoróforos. Danos não específica para o tecido vivo (fototoxicidade) está relacionada com a fotodegradação, e, por vezes, pode ser identificada utilizando sondas fluorescentes concebidos para o efeito ou 2,12 por exame da morfologia com ópticas de campo claro …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde Grant NS-024572 (para RSW) dos Estados Unidos.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| SGC5 | Biotium [Hayward, CA] | 70057 | Final conc:10 mM |
| FM1-43FX | Invitrogen [Carlsbad, CA] | F35335 | Final conc:7 mM |
| LysoTracker Red | Invitrogen [Carlsbad, CA] | L7528 | Final conc:0.2 mM |
| Solutions: | |||
| Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High KCL Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 86 mM | ||
| KCl | 60 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High Sucrose Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2. 5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| Sucrose | 0.5 M (17.1 gm/50 mL) | ||
| Equipment: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Axioplan 200 inverted microscope | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4mm | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | 175W Xenon arc lamp | www.sutter.com |
| Lambda 10-2 emission filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | www.sutter.com | |
| Sensicam CCD camera | Cooke Instruments [Tonawanda, NY] | www.cookecorp.com | |
| Cascade 512 CCD camera | Photometrics [Tucson, AZ] | www.photometrics.com | |
| Imaging dishes- made in-house-11cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins | |||
| Software: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Slidebook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations [Denver, CO] | Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation | www.intelligent-imaging.com |
| IMARIS 7.5.2 | Bitplane [South Windsor, CT] | Drift correction; 3D and 4D data presentation | www.bitplane.com |
| AfterEffects CS6 | Adobe [San Jose, CA] | Drift correction | www.adobe.com |
| ImageJ 1.46 | National Institutes of Health [Bethesda, MD] | Multiple plugins available;Stereo pair construction | http://rsbweb.nih.gov/ij |
| Zeiss LSM | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | Stereo pair construction | www.zeiss.com |
Referenzen
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