Nach Durchtrennung des Rücken, erwachsenen Zebrafisch haben die funktionelle Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der Larven Transparenz und schnellere Erholung zu nehmen, stellen wir ein Verfahren zur Durchtrennung des Rückenmarks Larven. Nach Durchtrennung beobachten wir sensorischen Erholung ab 2 Tage nach der Verletzung, und C-Bogen-Bewegung um 3 Tage nach der Verletzung.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Säugetiere nicht in sensorischen und motorischen Erholung nach einer Rückenmarksverletzung aufgrund des Fehlens von axonalen Nachwachsen unter dem Niveau von Verletzungen sowie die Unfähigkeit, Rückenneurogenese wieder aufzunehmen. Doch einige anamniotes einschließlich der Zebrafisch Danio rerio Ausstellung auch nach der kompletten Durchtrennung des Rückenmarks sowohl sensorische und funktionelle Wiederherstellung. Die erwachsenen Zebrafisch ist ein Modellorganismus für das Studium Regeneration nach Rückenmarksverletzungen, mit sensorischen und motorischen Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der in vivo Analyse der Regenerationsprozess in der transparenten Larven Zebrafisch als auch genetische Werkzeuge nicht in der Erwachsenen zugänglich zu machen, verwenden wir die Zebrafisch-Larven, um die Regeneration nach Rückenmarksdurchtrennung zu studieren. Hier zeigen wir ein Verfahren zur reproduzierbar und nachweisbar Trennung des Larvenrückenmark. Nach Durchtrennung, zeigt unsere Daten sensorischen Erholung Anfang mit 2 Tagen nach der Verletzung (dpi), Witzh ist der C-Bogen-Bewegung um 3 dpi und die Wiederaufnahme des freien Schwimmen von 5 dpi nachweisbar. So schlagen wir die Zebrafisch-Larven als Begleiter Werkzeug an die erwachsenen Zebrafisch für das Studium der Regeneration nach Rückenmarksverletzungen.
Einleitung
Schweres Trauma an den menschlichen Rückenmarks oft zu bleibenden Lähmungen und Gefühlsverlust unterhalb der Ebene der Schädigung aufgrund der Unfähigkeit, die Axone wieder wachsen oder reinitiate Genese 1,2. Im Gegensatz zu Säugetieren, aber anamniotes einschließlich Salamander und Zebrafisch (Danio rerio) zeigen kräftige Erholung auch nach der kompletten Rückenmarksdurchtrennung 3,4.
Die erwachsenen Zebrafisch ist ein gut etabliertes Modell für die Untersuchung der Wiederherstellungsprozess folgende Verletzungen des Rückenmarks 5-7. Nach der vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks, ist Wiede....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Zebrafisch wurden angehoben und nach Standardverfahren gezüchtet; Experimente wurden von der Universität von Utah Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.
1. Vorbereitung für Chirurgie Platten
- Machen Chirurgie Platten mit 60 mm Petrischalen und Sylgard 184 Silikonelastomer Kit nach Herstellerangaben. Füllen Gerichte nicht mehr als halb voll und lassen Sie polymerisieren. Shop abgedeckt bei Raumtemperatur.
2. Herstellung von Mikropipetten
- Fertigen Mikropipetten durch Erhitzen und Ziehen Dünnwand Borosilikat Kapillarrohr in einer Mikropipette Puller mit den gleiche....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Um die Schwere der Gewebeschädigung die Verletzungsstelle umgebenden reduzieren, ist die richtige Abschrägung der Mikropipette kritisch. 1A zeigt eine korrekt abgeschrägte Spitze. Mit einem Tipp, der zu breit ist (Abbildung 1B) neigt dazu, in höheren Todesopfer führen durch die erhöhte Wahrscheinlichkeit von nicking die dorsale Aorta, während ein Tipp, der zu schmal ist (Abbildung 1C) neigt dazu, Blick von der Haut statt Schneiden von Gewebe.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Wenn zunächst das Erlernen dieser Technik, empfehlen wir versuchen nicht mehr als 50-100 Querschnitten erhalten in einer einzigen Sitzung. Nach Beherrschung dieser Technik sind wir in der Lage, bis 300 Embryonen pro Stunde durchschneiden sich; aber dieses Niveau der Durchsatz erfordert ein paar Monaten der wöchentlichen Praxis. Wir empfehlen auch, gemeinsam mit einem Reporter-Linie und Überprüfung komplette Durchtrennung bis das Auftreten von unvollständiger Durchtrennung des Rückenmarks auf weniger als 1% reduziert.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir sind auf die Universität von Utah Zebrafisch-Anlage für die Tierhaltung verschuldet. RID wurde von NIH R56NS053897 unterstützt und LKB war ein Promotions Auszubildenden durch die HHMI Med-In-Grad-Initiative unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
20x E2 (1 L); 1x E2 (1 L);
td colspan="4"> bei RTtd colspan="4"> bei RT
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 60 mm Petrischale | VWR | 82050-544 | |
| 100 mm Petrischale | VWR | 89038-968 | |
| PDMS, Sylgard 184 Silikonelastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| Borosilikat-Kapillarschlauch: AD 1,00 mm, ID 0,78 mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| Pinzette | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| Disssektionsmikroskop | Nikon | SMZ6454 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | in Wasser 10 mg/ml auflösen, bei -20 μg lagern; C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| Applikator mit Wattespitze, Holz, 6-Zoll | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1 ml Spritze | BD | 309625 | |
| 27 G Nadel | BD | 305109 | |
| Fry Food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | bei -20 ° C |
| Mikropipetten-Abzieher | Sutter Instrument Co. | Modell P-97 | Box Filament FB330B< |
| lagern 17,5 g NaCl | Fisher | Scientific S671-500 | |
| 0,75 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2,90 g CaCl2· 2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4,90 g MgSO4· 7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0,41 g KH2PO4 | Fisher | Scientific P285-500 | |
| 0,12 g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10 ml); frisch machen, zusätzlich | |||
| 0,35 g NaCO3 | Sigma | S5761< | |
| 50 ml 20x E2 | |||
| lagern, 2 ml frisch, 500x NaCO3 |
Referenzen
- Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair. Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).
- Mikami, Y., et al.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
