Двухфотонное<em> В естественных условиях</em> Визуализация дендритных шипиков в мыши Cortex Использование разреженных черепа Подготовка
Summary
Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.
Abstract
В коре млекопитающих, нейроны образуют чрезвычайно сложных сетей и обмен информацией на синапсах. Изменения в синаптической силы, а также добавления / удаления синапсов, возникают в опыте-зависимым образом, обеспечивая структурную основу нейрональной пластичности. Как постсинаптических компонентов самых возбуждающих синапсов в коре головного мозга, дендритные шипы считается хорошим заменителем синапсов. Принимая преимущества генетики мыши и флуоресцентных методов маркировки, отдельных нейронов и их синаптических структур могут быть помечены в неповрежденном мозге. Здесь мы вводим протокол транскраниальной визуализации с использованием двухфотонного лазерной сканирующей микроскопии следовать флуоресцентно меченных постсинаптические дендритных шипиков с течением времени в естественных условиях. Этот протокол использует препарат разреженных черепа, который держит череп нетронутыми и позволяет избежать воспалительных эффектов, вызванных воздействием мозговых оболочек и мозга. Таким образом, изображения могут быть получены сразу после суrgery выполняется. Экспериментальная процедура может быть выполнена повторно через различные промежутки времени от нескольких часов до нескольких лет. Применение этого препарата также может быть расширена, чтобы исследовать различные области коры и слоев, а также другие типы клеток, в физиологических и патологических состояниях.
Introduction
Коре млекопитающих участвует во многих функциях мозга, от чувственного восприятия и движения управления для абстрактного обработки информации и познания. Различные корковые функции построить на различных нейронных цепей, которые состоят из различных типов нейронов передачи и обмена информацией в отдельных синапсов. Структура и функции синапсов последовательно вносятся изменения в ответ на опыте и патологий. В зрелом мозге, синаптической пластичности принимает форму обеих изменений прочностных и добавления / удаления обслуживаемых синапсов, играют важную роль в формировании и поддержании функциональной нервной схемы. Дендритные шипы постсинаптические компоненты большинства возбуждающих синапсов в мозге млекопитающих. Постоянная оборот и морфологические изменения шипами, как полагают, служат хорошим индикатором изменений в синаптических связей 1-7.
Двухфотонное лазерного сканирования микроспектроскопии предлагает глубокое проникновение через толстые, непрозрачные препаратов и низкой фототоксичности, что делает его пригодным для живого изображения в интактном мозге 8. В сочетании с флуоресцентной маркировки, изображений двухфотонного представляет собой мощный инструмент заглянуть в живого мозга и следовать структурную реорганизацию в отдельных синапсов с высоким пространственным и временным разрешением. Различные методы были использованы для получения мышей в течение 9-13 живого изображения. Здесь мы описываем препарат разреженных черепа в естественных условиях двухфотонного визуализации исследовать структурную пластичность постсинаптических дендритных шипиков в коре мыши. Используя этот подход, наши недавние исследования изображен динамичную картину дендритных изменений позвоночника в ответ на двигательного навыка обучения с ростом доступности трансгенных животных с флуоресцентной меченых нейронов подмножеств и быстрого развития в естественных условиях методов маркировки, подобные процедуры, описанные здесь, могут быть применены чтобы Investigaтэ другие типы клеток и области коры, в сочетании с другими манипуляциями, а также используется в моделях болезни 16-23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для получения успешной подготовки разреженных черепа, несколько шагов в этом протоколе имеют решающее значение. 1) Толщина черепа. Черепная кость имеет многослойную структуру, с двумя слоями высокой плотности компактной кости и средний слой низкой плотности губчатой кости. В то вре…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Джеймса Перна для графического иллюстрации. Эта работа была поддержана грантами от Национального института психического здоровья в YZ
Materials
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
Referenzen
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).
- Yu, X., Zuo, Y. Spine plasticity in the motor cortex. Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).
- Harms, K. J., Dunaevsky, A. Dendritic spine plasticity: looking beyond development. Brain research. 1184, 65-71 (2007).
- Segal, M. Dendritic spines and long-term plasticity. Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).
- Tada, T., Sheng, M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis. Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature protocols. 5, 201-208 (2010).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7, 981-984 (2010).
- Szu, J. I., et al. Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging. J Vis Exp. , (2012).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
- Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).
- Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).
- Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis. J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).
- Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices. Glia. 60, 541-558 (2012).
- Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465, 478-482 (2010).
- Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation. J Vis Exp. , (2010).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. , (2010).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
- Zhang, L., et al. Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window. J Vis Exp. , (2012).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. , (2012).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240, 237-246 (2001).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. , (2010).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).
- Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PloS one. 3, (2008).
