Стимуляция цитоплазматической ДНК зондирования Пути<em> In Vitro</em> И<em> В Vivo</em
Summary
Целью протокола является использование оптимальные способы стимулирования цитоплазматические пути зондирования ДНК в клетках и в естественных условиях. Это достигается за счет улучшения поколение долгого, двухцепочечной ДНК во тупым концом перевязки. Клетки или мышей затем трансфицируют с использованием реагента для трансфекции липидов.
Abstract
Для того чтобы эффективно стимулировать врожденную иммунную реакцию, ДНК должна быть достаточной длины и чистоты. Мы представляем метод, где двухцепочечной ДНК (дц), который имеет все необходимые характеристики, чтобы стимулировать цитоплазматический ДНК пути зондирования могут быть сгенерированы дешево и с легкостью. К concatemerization коротких синтетических олигонуклеотидов, которые не имеют (CpG мотивы), дцДНК могут быть получены, чтобы иметь достаточную длину, чтобы активировать цитозольного зондирования ДНК пути. Этот протокол включает в себя тупым концом лигирование олигонуклеотидов в присутствии полиэтиленгликоля (ПЭГ), который обеспечивает среду для эффективного лигирования произойти. В concatemers дцДНК могут быть использованы, следующие очистки экстракцией фенолом / хлороформом, чтобы имитировать врожденного иммунного ответа в пробирке с помощью стандартных протоколов трансфекции. Эта ДНК может быть также использован для стимуляции врожденного иммунитета в естественных условиях внутрикожной инъекцией в ушной раковины мыши, например. Постандартизации процесса concatemerization и последующие протоколы стимуляции, надежным и воспроизводимым активации иммунной системы могут быть получены.
Introduction
ДНК является жизненно важным компонентом всех организмов и клеток, которые эукариоты держать в определенных отсеков. Одна из функций иммунной системы, чтобы определить, когда такое компартментализация ломается или когда инородный материал вводится в организм через нарушение физических, внешних барьеров. В человеческом организме существует целый ряд белков, которые существуют, чтобы помочь ухудшить небольших количеств ДНК, которые могут избежать правильный дробления; ДНКазы I, II и III, сломать ДНК в плазме, эндосомы и цитозоле, соответственно. Тем не менее, было показано, что мыши, лишенные ДНКазу II умирает от тяжелой анемии, вызванной чрезмерным продукции интерферонов 1, предполагая, что врожденная иммунная система реагирует на экстра-ядерная ДНК. Этот ответ имеет место даже у мышей, которые полностью дефицит платной, как мощности передачи сигнала рецептором. Многочисленные исследования показали, что в настоящее время стимулятор генов интерферона (жало) 2 и БАК-связывания киназы 1 (ТБК1) 3 участвуют в обнаружении ДНК в цитоплазму и что этот сигнальный путь включает интерферон регуляторного фактора (МАФ) -3 4. Последующее IRF3-зависимой транскрипции цитокина, хемокина, и генов интерферона характерна для врожденного иммунного ответа к любой патогена или опасности, связанной молекулярной картины (ПАМП или влажные) 5.
Желание изучать внутриклеточные пути нуклеиновые кислоты зондирования привело к требованию, чтобы разработать надежные и воспроизводимые способы стимулирования клеток путем введения ДНК или РНК в клетки без активации другие врожденные иммунные ответы. Один из способов, с помощью которых жало / TBK1 / IRF3 путь может быть стимулировано путем использование катионных липидов реагентов трансфекции для доставки нуклеиновой кислоты в цитоплазму, где он может получить доступ с помощью датчиков, таких как ДНК, ДНК-ПК, IFI16, и CGAS 6-8.
Характеристики ДНК, которая в настоящее время поняты, чтобы позволить эффАктивация циент цитоплазматической врожденного иммунного ответа без стимуляции других путей являются его длина, масса, чистота, и отсутствие CpG мотивы 4,7,9. Синтетические олигонуклеотиды хорошо подходит для цели получения врожденной иммунной реакции, поскольку они позволяют последовательность ДНК, чтобы быть оптимизированы и получают в виде чистых химических соединений. 45 пар оснований иммуно-стимулирующий ДНК (ИСД) последовательность была определена Стетсоном и соавт. 4 как подходит, CpG-последовательности, свободной для этой цели. Эта последовательность двухцепочечной ДНК является в противном случае случайный и не имеет особенностей вне его отсутствия CpG мотивов. Мы обнаружили, что по concatemerizing ИСД олигонуклеотида в значительно более нитей увеличивает величину стимуляции 7. Генерация concatemerized ИСД Поэтому полезно для стимулирования цитоплазматический врожденный иммунный ответ. Здесь мы представляем протоколы за подготовку этого реагента и как он может быть использован для активации зондирования ДНК путь впробирке, а также в естественных условиях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все исследования на животных проводятся по утвержденным институциональных протоколов и руководств по уходу за животными.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протоколы, описанные здесь, используются для создания двухцепочечной ДНК, чтобы стимулировать цитозольного врожденной иммунной реакции с воспроизводимые результаты в широком диапазоне типов клеток и в естественных условиях. Так как основной реагент субстрат используется синте…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы не имеют подтверждения.
Materials
| Forward Primer | Integrated DNA technologies | n/a | TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGATCTACA |
| Reverse Primer | Integrated DNA technologies | n/a | TGTAGATCATGTACAGATCAGTCATAGATCACTAGTAGATCTGTA |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P-4463 | |
| Molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| T4 Polynucleotide Kinase | Promega | M4101 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | |
| Phenol:Chloroform | Fisher Chemical | BPE1752p-400 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C/4960/PB08 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| DNA gel loading buffer | New England biolabs | B7021S | |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Optimem | Life Technologies | 11058021 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bioscience | MIR 2300 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80901 Model 1705 | |
| 30G needles | BD bioscience | 304000 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | |
| Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Oligo(dT) primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | |
| Super Script III reverse transcriptase | Life Technologies | 56575 | |
| First strand cDNA synthesis buffer | Life Technologies | y02321 | |
| SybrGreen qPCR Fast master mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| cxcl10 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | ACTGCATCCATATCGATGAC |
| cxcl10 murine reverse primer | Integrated DNA technologies | n/a | TTCATCGTGGCAATGATCTC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
Referenzen
- Yoshida, H., Okabe, Y., Kawane, K., Fukuyama, H., Nagata, S. Lethal anemia caused by interferon-beta produced in mouse embryos carrying undigested DNA. Nat. Immunol. 6, 49-56 (2005).
- Ishikawa, H., Ma, Z., Barber, G. N. STING regulates intracellular DNA-mediated, type I interferon-dependent innate immunity. Nature. 461, 788-792 (2009).
- Ishii, K. J., et al. TANK-binding kinase-1 delineates innate and adaptive immune responses to DNA vaccines. Nature. 451, 725-729 (2008).
- Stetson, D. B., Medzhitov, R. Recognition of cytosolic DNA activates an IRF3-dependent innate immune response. Immunity. 24, 93-103 (2006).
- Pichlmair, A., Reise Sousa, C. Innate recognition of viruses. Immunity. 27, 370-383 (2007).
- Unterholzner, L., et al. IFI16 is an innate immune sensor for intracellular DNA. Nat. Immunol. 11, 997-1004 (2010).
- Ferguson, B. J., Mansur, D. S., Peters, N. E., Ren, H., Smith, G. L. DNA-PK is a DNA sensor for IRF-3-dependent innate immunity. Elife. 1, e00047 (2012).
- Sun, L., Wu, J., Du, F., Chen, X., Chen, Z. J. Cyclic GMP-AMP synthase is a cytosolic DNA sensor that activates the type I interferon pathway. Science. 339, 786-791 (2013).
- Honda, K., Taniguchi, T. IRFs: master regulators of signalling by Toll-like receptors and cytosolic pattern-recognition receptors. Nat. Rev. Immunol. 6, 644-658 (2006).
- Karayel, E., et al. The TLR-independent DNA recognition pathway in murine macrophages: Ligand features and molecular signature. Eur. J. Immunol. 39, 1929-1936 (2009).
