Understanding the neural substrates of behavior requires brain circuit ensemble recording. Because of its genetic tractability, the mouse offers a model for circuit dissection and disease mimicry. Here, a method of designing and fabricating miniaturized probes is described that is suitable for targeting deep brain structure in the mouse.
O número de investigações fisiológicas no musculus rato, mus, sofreu um aumento recente, em paralelo com o crescimento nos métodos de genética de segmentação para dissecção microcircuito e modelagem de doenças. A introdução de Optogenetics, por exemplo, tem permitido a manipulação bidireccional de neurónios identificados geneticamente, em uma resolução temporal sem precedentes. Para capitalizar sobre essas ferramentas e obter insights sobre as interações dinâmicas entre microcircuitos do cérebro, é essencial que a pessoa tem a capacidade de gravar a partir de conjuntos de neurônios no interior do cérebro deste pequeno roedor, em ambas as preparações fixo-cabeça e se comportando livremente. Para gravar a partir de estruturas profundas e camadas de células distintas requer uma preparação que permite o avanço precisa de eletrodos para regiões cerebrais desejados. Para gravar conjuntos neurais, é necessário que cada um dos eléctrodos ser independentemente móvel, permitindo que o experimentador para resolver as células individuais, deixando neighbeletrodos Oring imperturbável. Para fazer as duas coisas em um rato comportando livremente requer uma unidade de eletrodo que é leve, resistente e altamente personalizável para a segmentação de estruturas cerebrais específicas.
Uma técnica para a concepção e fabricação de miniatura, peso ultraleve, matrizes de eletrodos de micro-unidade que são individualmente personalizável e facilmente montado a partir de peças disponíveis comercialmente é apresentado. Estes dispositivos são facilmente escalável e pode ser personalizado para a estrutura a ser alvo; que tem sido utilizado com sucesso para gravar a partir de regiões do tálamo e do córtex de um animal comportando livremente durante seu comportamento natural.
Mus musculus tem, devido à sua rastreabilidade genética, tornar-se rapidamente o modelo animal de escolha para os fisiologistas interessados em nível de microcircuito dissecção de neurônios identificados geneticamente e na investigação de modelos de rato da doença humana. Por exemplo, a recente introdução de ferramentas genéticas causais, tais como atuadores genéticos optogenetic e químicas permitiu experimentalistas para testar a necessidade e suficiência dos circuitos neurais identificados no comportamento 1-4. A ampla disponibilidade de transgênicos linhagens recombinantes driver do mouse (CRE-linhas), ampliou a facilidade experimental pelo qual os subtipos de neurônios são direcionados, somando-se o valor do mouse para estas experiências 5.
Da mesma forma, as telas genéticas e genômicas amplas associações de distúrbios neurológicos e psiquiátricos comuns têm facilitado a identificação de fatores de risco genético para a doença cerebral 6,7. Estes avanços, combinados com o crescimentocaixa de ferramentas para a manipulação genética e engenharia de genoma em camundongos, fizeram o organismo de escolha para a modelagem de doenças humanas. A combinação de modelos de doenças e ferramentas genéticas causais oferece uma oportunidade sem precedentes para a compreensão de doenças do cérebro e identificar alvos no nível do circuito de intervenções.
Para tirar pleno partido destas ferramentas moleculares e ganhar a introspecção em função microcircuito na saúde e na doença, é essencial para associá-los com leituras fisiológicos da atividade cerebral. Idealmente, o experimentador seria capaz de controlar um grande número de neurónios, mantendo a resolução de células simples. Extracelulares, gravações multi-eletrodos em animais se comportando livremente fornecer tal oportunidade; no entanto, o uso desta tecnologia no rato tem sido limitado. Para gravar a partir de pequenos alvos (por exemplo, a camada CA1 do hipocampo), o uso de eletrodos ajustáveis é necessário como pequenos movimentos em eletrodos de registro seguintes Surgicimplantação al tornar impossível a manutenção da estabilidade de gravação 8,9. Tradicionalmente, os métodos que têm sido empregados para mover eletrodos dentro do cérebro impor limitações de peso quando usado no rato, tornando-se um desafio para a gravação par de um grande número de neurônios com o comportamento neste organismo.
Aqui, os métodos são introduzidos para a fabricação em miniatura, ultra-leves, matrizes de microeletrodos que são individualmente customizável a região do cérebro a ser alvo, optogenética-compatível, e facilmente montado a partir de peças disponíveis no mercado. Cada "microdrive" dentro do multi-eletrodo "hipervelocidade" utiliza um mecanismo de mola e parafuso para fazer avançar o eletrodo e um trilho de plástico, integrado ao corpo da hipervelocidade, para contrariar o torque do parafuso. Primeiro, o processo de concepção dos corpos Hyperdrive e microdrives em um programa CAD para a impressão 3D é descrito. Ao projetar corpos Hyperdrive que são personalizadosde estruturas específicas, é possível aumentar a precisão de orientação e para aumentar ainda mais o rendimento da preparação. Em segundo lugar, o processo de fabricação é descrito em detalhe, em que a matriz de multi-eléctrodo é montada a partir de peças de mão que estão disponíveis comercialmente. Esta técnica tem sido utilizada, com sucesso, para gravar a partir de conjuntos de neurônios no hipocampo, tálamo e córtex no animal se comportar livremente durante o forrageamento natural e tarefas operantes.
Este protocolo descreve o processo de construção de uma matriz microdrive ultra-leve para alvejar uma única ou múltiplas regiões cerebrais no mouse. Após as etapas finais de construção, a hipervelocidade está pronto para ser implantado usando técnicas de implante cirúrgico padrão e afixado ao crânio do rato com cimento dental. Pós-implantação, os eletrodos podem cada ser avançado independentemente usando uma pequena chave de fenda, enquanto o mouse é contido com a mão. A distância por sua vez, que cada eletrodo avanços é determinado pelo passo do parafuso. Utilizando os parafusos referenciados aqui avança cada eletrodo aproximadamente 150 mm por sua vez, embora metade e quartas de voltas pode ser utilizado para uma maior resolução.
As dimensões do esboço na Figura 1B determinar o tamanho total do implante, por conseguinte, uma forma óbvia para dimensionar implantes bidireccional é a alteração das dimensões em que esboço crítico. Além disso, the o comprimento dos parafusos pode ser estendida para atingir as estruturas mais profundas do cérebro. Recomendamos personalizado feito parafusos de titânio, como os que são leves e menos frágil do que o aço. Note-se que os trilhos antitorque preciso dimensionar de forma linear com o comprimento do parafuso, e, neste ponto, não se determinou o comprimento máximo a que estas estruturas podem ser impressas. Para atingir várias regiões do cérebro, a forma da parte inferior pode ser modificado. A adição de arruelas conhecidos tamanho (espessura de 200 um), poderia fornecer espaçadores necessários entre polyimides segmentação estruturas cerebrais separados (por exemplo, o hipocampo eo córtex pré-frontal). Estes poderiam ser incluídos nas etapas de montagem parte de fundo, e depois cortados após o epoxi endurece.
A grande limitação deste projeto é a sua dependência de software proprietário (Solidworks, neste caso). O desenvolvimento futuro de programas de código aberto que fornecem interfaces conviviais propício para a concepção de tal equipamento com o mínimo de fu engenhariarodada seria de grande benefício para a comunidade da neurociência.
Este método proporciona várias vantagens sobre os métodos existentes. Primeiro, o design é simples, dependente de poucos desenhos (Figura 1). Segundo, é ultra-leve, sem necessidade de cimento dental ou material pesado para entrar em sua montagem. Em geral, pesa cerca de 1,7 g – cerca de um terço do peso dos implantes comercialmente disponíveis de funcionalidade semelhante. Em terceiro lugar, ele não requer nenhum equipamento especializado para fazer – o corpo do implante pode ser impresso em 3D a partir de várias fontes (por exemplo approto.com, mas existem vários outros); os parafusos podem ser feitos (por exemplo antrinonline.com); as molas estão comercialmente disponíveis (por exemplo leesprings.com); e como resultado a totalidade do processo de montagem pode acontecer em um dia. Finalmente, estes implantes têm sido usados para gravar a partir de várias regiões do cérebro durante o forrageamento naturais, tarefas comportamentais estruturadas e sono (Figura5).
As aplicações futuras deste método incluem a implementação de sua escalabilidade. É provável que o implante pode ser dimensionado bidireccionalmente simplesmente mudando 1) o tamanho do esboço na Figura 1B e, 2) o número de recipientes de micro-unidade (Figura 1D) modelado. Por exemplo, ele pode ser escalado para baixo, para registro de agir livremente ratos início do desenvolvimento, e escalado para cima, para gravar a partir de ratos, coelhos, furões e primatas não-humanos, talvez.
A palavra final é para lembrar ao leitor que críticos para a implementação bem sucedida do método descrito é o protótipo de todas as modificações que implementar para .stl arquivos de projeto em anexo. O leitor notará, por exemplo, que o desenho em anexo contém um "Figura 8" anti-torque ferroviário. Este foi o melhor projeto possível, dada a limitação de impressão 3D, como muitas vezes é necessário que nós perfuramos esses buracos. Tê-lo ser um círculo, se cortesiaestabilidade romise, mas ter que ser um quadrado ou uma forma angular que limitaria a capacidade de corrigir imperfeições de impressão 3D por perfuração.
The authors have nothing to disclose.
We thank members of the Wilson lab for their helpful advice on the fabrication method.
This work was supported by the Simons Foundation, a NIH pathway to independence career award from the NINDS and a NARSAD Young Investigator Award (to M.M.H.) as well as grants from the NIH (to M.A.W.).
Part Name | Manufacturer | Catalogue # (if applicable) | Part Description |
Microdrive screws | Antrin | Half Circle .6UNM Titanium Screws. 8mm thread. 9mm length from under head. | |
Tap-ease | AGS CO. | #TA2 | Tapping Grease |
Microdrives | See .STL file | ||
Drive Body | See .STL file | ||
Outer Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113300022-012 | Length:12’’, |
ID:.0071’’, | |||
OD:.0116’’, | |||
WALL:.00225’’ | |||
Inner Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113900001-012 | Length: 12’’, |
ID:.0035’’, | |||
OD:.0055’’, | |||
WALL:.001’’ | |||
Grounding Wire | A-M Systems, Inc. | Catalog # 791900 | .008'' Bare, .011'' Coated |
Tri-Flow | Teflon based lubricant – Aerosol | ||
Microdrive Springs | Lee Spring | Part # CB0050B 07 E | Outside Diameter: 1.016 mm |
Hole Diameter: 1.193 mm | |||
Wire Diameter: 0.127 mm | |||
Free Length 10.160 mm | |||
Solid Length 3.581 mm | |||
Z-poxy 5 Minute | Pacer Technology (Zap) | PT37 | |
Silver Paint | GC Electronics | Part #: 22-023 | Silver Print II |
Tri-Flow | 20009 | ||
26 Gauge Hypodermic Tube – Stainless Steel | Small Parts | HTXX-26T-12-10 | Length: 12’’ |
ID: .012’’ | |||
OD: .018’’ | |||
EIB screws | Component Supply Co. | MX-0090-03SP | #00-90 x 3/16’’ |
Fine Scissors – Toughcut | Fine Science Tools | 14058-09 | 22mm |
Transparency Paper | 3M | PP2500 | |
Aluminum Foil | Reynold's Wrap Heavy Duty | Extra Thick |