Evaluatie anti-schimmel activiteit van geïsoleerde alveolaire macrofagen door confocale microscopie

Summary

Een werkwijze om het vermogen van geïsoleerde muis alveolaire macrofagen om de groei van Aspergillus gefagociteerde sporen bedienen door confocale microscopie evalueren.

Abstract

De long is een interface waarbij gastheercellen routinematig worden blootgesteld aan microben en microbiële producten. Alveolaire macrofagen zijn de eerste lijn fagocytcellen dat geïnhaleerde schimmels en andere microben tegenkomen. Macrofagen en andere immuuncellen herkennen Aspergillus motieven door pathogeen herkenning receptoren en initiëren downstream ontstekingsreacties. De fagocytensysteem NADPH oxidase genereert reactieve zuurstof tussenproducten (ROI) en is van cruciaal belang voor de afweer. Hoewel NADPH oxidase is essentieel voor neutrofiel-gemedieerde afweer ^{1 – 3,} het belang van NADPH oxidase in macrofagen is niet goed gedefinieerd. Het doel van deze studie was om de specifieke rol van NADPH oxidase in macrofagen af te bakenen in het bemiddelen afweermechanismen tegen A. fumigatus. We vonden dat NADPH oxidase in alveolaire macrofagen regelt de groei van gefagociteerde A. fumigatus sporen ^4. Hier beschrijven we een methode voor het beoordelen van het vermogen van de muis eenlveolar macrofagen (AM's) om de groei van Aspergillus gefagocyteerd sporen (conidia) regelen. Alveolaire macrofagen zijn gekleurd in vivo en tien dagen later geïsoleerd van muizen door bronchoalveolaire lavage (BAL). Macrofagen uitgeplaat op dekglaasjes, dan geënt met groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie A. fumigatus sporen. Op bepaalde tijdstippen worden cellen gefixeerd en het aantal intacte macrofagen met gefagociteerde sporen wordt beoordeeld door confocale microscopie.

Introduction

Alveolaire macrofagen zijn de eerste lijn fagocytcellen dat geïnhaleerde microben tegenkomen. Macrofagen herkennen Aspergillus motieven door pathogeen herkenning receptoren, innemen en beperken de groei van geïnhaleerde sporen (conidiën), en initiëren ontstekingsreacties. De fagocytensysteem NADPH oxidase zet moleculaire zuurstof om superoxide anion en downstream reactieve zuurstof tussenproducten (ROI). Chronische granulomateuze ziekte (CGD) is een erfelijke aandoening van het NADPH oxidase gekenmerkt door ernstige bacteriële en schimmelinfecties en overmatige ontstekingsreacties.

Hoewel NADPH oxidase is essentieel voor neutrofiel-gemedieerde afweer ^{1 – 3,} het belang van NADPH oxidase in macrofagen is niet goed gedefinieerd. Voorafgaande studies hebben aangetoond dat alveolaire macrofagen innemen en doden Aspergillus sporen, terwijl neutrofielen voornamelijk richten op de hyphal fase ^5. Er zijn tegenstrijdige results over de rol van NADPH oxidase in macrofagen in het beheersen van de groei van A. fumigatus sporen ^{6, 7.}

Het doel van deze methode was om de specifieke rol van NADPH oxidase in macrofagen bakenen als mediator afweermechanismen tegen A. fumigatus sporen. We vonden dat NADPH oxidase in alveolaire macrofagen regelt de groei van gefagociteerde A. fumigatus sporen ^4. Het nauwst model van de gastheer op geïnhaleerd schimmels, gebruikten we alveolaire macrofagen geoogst door bronchoalveolaire lavage van gestimuleerde muizen onmiddellijk na offer. Het gebruik van geïsoleerde alveolaire macrofagen stelde ons in staat om zich te concentreren op hun antifungale activiteit in de afwezigheid van andere immuuncellen (bijv. aangeworven neutrofielen) die verdedigen tegen Aspergillus in vivo. Bij deze werkwijze werden alveolaire macrofagen gekleurd vivo voor zo oogst om de hoeveelheid post-harvest manipulatie minimaliseren. </ P>

Een ander voordeel van dit protocol is het gebruik van een GFP-expressie A. fumigatus stam. Deze schimmel uitdrukking GFP uit de conidiale stadium door de hyphal podium en heeft geen behoefte aan verdere kleuring. Om beelden met meer detail bieden we kozen confocale microscopie die de reconstructie van driedimensionale structuren van de verkregen beelden maakt. Drie-dimensionale reconstructie geeft de mogelijkheid om tussen hyfen groeien rond plaats of door een macrofaag. Conidia kan ook juist onderscheiden als intracellulaire versus extracellulair.

Protocol

Alle procedures uitgevoerd op dieren in deze studie werden goedgekeurd door het Comite Animal Care en gebruik bij Roswell Park Cancer Institute en aan alle provinciale, federale en National Institutes of Health regelgeving. 1. In vivo Macrophage Labeling Opmerking: PHK26 is een lipofiele kleurstof die door fagocyten wordt afgelezen in omloop en in de weefsels bij intraveneuze toediening (iv). PKH26 werd gebruikt voor in vivo labeling van de hoevee…

Representative Results

Verzamelen alveolaire macrofaag door BAL van gestimuleerde muizen zal resulteren in een> 95% zuivere populatie op basis van cytologie. De 3 en 7 uur (figuur 2) tijdstippen vooraf aan de hyfen stadium van schimmelgroei en maken een vergelijking van fagocytische efficiëntie van conidia tussen genotypen. De 14 uur tijdstip is waar genotypen vergelijkbaar wat betreft de mogelijkheid om de overgang van gefagociteerde conidia de weefsel-invasieve hyfen fase (figuur 3) remmen. Intact…

Discussion

Met deze aanpak voor ex vivo analyse van de antifungale activiteit van macrofagen met in vivo schimmel uitdaging we eerder aangetoond dat NADPH oxidase in macrofagen een belangrijke rol in de verdediging tegen A. speelt fumigatus ^4. Het gebruik van geïsoleerde alveolaire macrofagen kunnen wij concentreren op hun antifungale activiteit in de afwezigheid van andere immuuncellen (bijvoorbeeld geworven neutrofielen) die verdedigen tegen Aspergillus in vivo. <…

Materials

PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4CL	Sigma	A0171	Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3	Sigma	P91444	Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA	Sigma	E6758	Used to make ACK red cell lysis buffer
22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
insulin syringes
6 ml syringes
4-way stopcock	Fisher Scientific	50-700-077
suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	heat inactivated
Hema 3 Stain Set	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein			provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 micron Cell Strainers	BD Falcon	64753-00
scissors
forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Cell Culture Incubator			37 °C, 5%  CO2
22X22 mm micro cover glass	VWR	48366-227	glass coverslips
6 well Cell Culture Plates	Corning	3506
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield Mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner			Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope