A Novel<em> In vivo</em> Gene Transfer Techniek en<em> In vitro</em> Cel-gebaseerde testen voor de studie van botverlies bij musculoskeletale aandoeningen
Summary
Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.
Abstract
Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.
Introduction
Musculoskeletale aandoeningen invloed op miljoenen mensen in de Verenigde Staten en de huidige ernstige gevolgen voor de nationale en lokale systemen gezondheid 1. Deze aandoeningen worden gekenmerkt door het verlies van bot-en gewrichtsziekten functie die uitgebreide behandeling en lange periodes van herstel nodig hebben. Gewoonlijk, een relatieve toename van het aantal en / of activiteit van osteoclasten, cellen gespecialiseerd bot resorberen, bij osteoporose en artritis waargenomen 2. Onder fysiologische omstandigheden het aantal en de activiteit van osteoclasten wordt geregeld door receptor activator van nucleaire factor κ B-ligand (RANKL), die wordt geproduceerd door osteoblasten. Osteoprotegerine (OPG), is een decoy receptor voor RANKL ook geproduceerd door osteoblasten 3 In vivo diermodellen dat de systemische overexpressie van sRANKL, of verwijdering van OPG betrokken zijn zeer waardevol bij osteoporose onderzoek.; Deze werkwijzen vereisen het genereren van transgene muizen 4,5. Hier, een nieuw alternatiefWerkwijze overexpressie sRANKL voor de studie van spier-gerelateerde stoornissen beschreven. Specifiek minicircle (MC)-DNA-technologie en hydrodynamische levering methoden werden gebruikt om genoverdracht van sRANKL in vivo te bereiken en overexpressie muis sRANKL systemisch 6.
Deze methode is ook een aanvulling op andere in vivo modellen van osteoporose, zoals hormonale modulatie van osteoclasten na ovariëctomie 7 en dieetinterventie door laag-calcium dieet 8. Deze modellen zijn zeer nuttig om de verschillende aspecten van het bewegingsapparaat gerelateerde stoornissen maar ze chirurgische procedures vereisen en kan tot enkele maanden, tegen aanzienlijke kosten 9 bestuderen. Ovariëctomie (OVX) knaagdier model is een proefdiermodel waar verwijdering van de eierstokken leidt tot een tekort aan oestrogeen waardoor de menselijke postmenopauzale osteoporose 10 nabootsen. Human postmenopauzale osteoporose, een aandoening waarbij oestrogeen Deficirantie leidt tot een verhoogd risico op botbreuken en osteoporose treft ongeveer acht miljoen vrouwen in de Verenigde Staten alleen. Hoewel de OVX model is handig voor postmenopauzale osteoporose biedt beperkte voordelen in het bestuderen van osteoporose in het algemeen. Oestrogeen onderdrukt botverlies, door het induceren van osteoclasten en osteoblasten remmen apoptose, derhalve in zijn afwezigheid een verhoogde activiteit van de osteoclasten wordt waargenomen 10-12. Een RANKL-OPG-ratio onbalans die botresorptie gunsten is ook waargenomen 13. Echter oestrogeendeficiëntie in vivo ook gepaard met verlaagde transformerende groeifactor β (TGF β), verhoogde interleukine-7 (IL-7) en TNF, IL-1 en IL-6 14,15. Aangezien deze cytokinen bekend botremodellering modulerende functies onafhankelijk van de RANKL-route, is het onmogelijk om eventuele osteoclast activering kenmerk uitsluitend de RANKL RANK-as. De in dit document beschreven model stelt onderzoekers in staat om te studeren in vivo RANKL-RANK as in osteoclastogenese en botverlies zonder pro-inflammatoire cytokines in vergelijking met OVX knaagdier modellen.
Bovendien, in vitro osteoclastogenese technieken zijn essentiële instrumenten om osteoclasten activering studeren voor potentiële therapeutische behandelingen van musculoskeletale aandoeningen. Eerdere studies hebben ook aangetoond dat het kweken van muizen beenmerg afgeleide macrofagen (BMMs), muis-macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) en muis sRANKL kan leiden tot differentiatie van osteoclasten 3,16,17. Hier, de protocollen meerkernige osteoclast-achtige cellen uit muizen beenmerg en uit humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) in vitro 18 genereren beschreven. Het celgebaseerde proeven vereist een volwassen terminaal gedifferentieerd en volledig functionele osteoclasten bepalen worden ook kort beschreven. Deze in vitro technieken aanvulling op de roman in vivo benadering en samen dienen als powerful onderzoeksinstrumenten om de differentiatie van osteoclasten en activering te bestuderen. Met deze systemen kunnen wetenschappers osteoclasten in vivo en in vitro genereren en bepalen de prikkels en signalen nodig zijn voor de proliferatie en activering en test de effectiviteit van farmacologische en biologische remmers.
Protocol
Representative Results
Discussion
Musculoskeletale aandoeningen zijn belangrijkste oorzaken van morbiditeit en invaliditeit en zijn samengesteld uit meer dan 150 ziekten en syndromen; die ongeveer 90 miljoen Amerikanen vandaag. Gewrichtsontsteking en botafbraak zijn overheersende kenmerken van musculoskeletale aandoeningen, met inbegrip van artritis en osteoporose. Osteoporose is een aandoening die bot integriteit verzwakt, wat vaak leidt tot breuken van het bot. Artritis is een chronische, invaliderende ziekte die wordt gekenmerkt door een ontsteking v…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.
Materials
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
Referenzen
- Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
- Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
- Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
- Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
- Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
- Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
- Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
- Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
- Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
- Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
- Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
- Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. Regulation of osteoclast function. J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).
- Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
- Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
- Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
- Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
- Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
- Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis – a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
- Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
- Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
- Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
- Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
- Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
- Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).
