En vivo de imágenes de Dauer-específica neuronal Remodelación en C. elegans

Summary

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Abstract

Los mecanismos que controlan el estrés inducido por la plasticidad fenotípica en animales son frecuentemente complejos y difíciles de estudiar in vivo. Un ejemplo clásico de la plasticidad inducida por el estrés es la etapa dauer de C. elegans. Dauers son una etapa larval de desarrollo alternativo formado bajo condiciones de bajas concentraciones de los alimentos bacteriana y altas concentraciones de una feromona Dauer. Dauers muestran amplia plasticidad del desarrollo y del comportamiento. Por ejemplo, un conjunto de cuatro cuadrantes interior-labial (IL2Q), las neuronas se someten a una amplia remodelación reversible durante la formación de Dauer. Utilizando la entrada vías ambientales de regulación Dauer bien conocido, un método previamente establecido para la producción de feromona Dauer crudo a partir de cultivos de nematodos líquido a gran escala se demuestra. Con este método, una concentración de 50.000 – 75.000 nemátodos / ml de cultivo líquido es suficiente para producir una muy potente feromona Dauer crudo. La potencia feromona crudo es determined mediante un bioensayo de respuesta a la dosis. Por último, se describen los métodos utilizados para in vivo time-lapse de los IL2Qs durante la formación de dauer.

Introduction

Plasticidad fenotípica, incluyendo la plasticidad del desarrollo y del comportamiento, es importante para las adaptaciones a las condiciones ambientales adversas y se considera una fuerza impulsora en la evolución ^1. C. elegans es un organismo modelo utilizado con frecuencia para estudios en el desarrollo y la neurobiología. En condiciones ideales, C. elegans se desarrolla a través de cuatro estadios larvarios antes de entrar en la etapa reproductiva de adultos. Sin embargo, en condiciones de baja disponibilidad de alimentos y las altas densidades de población, C. elegans puede someterse a un interruptor de desarrollo y entrar en una de larga duración y resistente a la tensión etapa Dauer ^2. Dauers muestran varias diferencias morfológicas y de comportamiento de los no dauers que probablemente median esta resistencia al estrés. Las señales ambientales y los mecanismos genéticos que regulan la entrada dauer han sido ampliamente descrito ^{3, 4, 5, 6, 7.} Sin embargo, los mecanismos moleculares que controlan los cambios fenotípicos individuales que ocurren ddauer formación urante son menos conocidos.

El examen de los fenotipos dauer específica requiere la producción de animales dauer. Esto se puede lograr de tres maneras: 1) Levantar partir de un cultivo de C. hambre elegans, 2) uso de la formación de dauer constitutiva (daf-c) mutantes, 3) Inducción de la formación de dauer través de feromona purificado. Es relativamente sencillo para recoger dauers de una placa estándar NGM con una C. población elegans que ha agotado su suministro de alimentos-bacteriana. En nuestras manos, una placa estándar NGM originalmente se siembra con 50 l de OP50 Escherichia coli, se dejó crecer durante 3 días y posteriormente inoculadas con 3 – 4 adultos hermafroditas se mantuvo a 25 ° C, se agotará el suministro de alimentos dentro de una semana y producir varios miles dauers dentro de 3 días adicionales (además de numerosos no dauers hambre). Sin embargo, este método es insatisfactorio para examinar procesos que ocurren durante la muda en dauer. Es difícil determinar cuál de los varios miles de animales en un plato típico hambriento están entrando en dauer. Además, el uso de una placa de hambre no ofrece ninguna posibilidad para la sincronización. El uso de mutantes daf-c permite la sincronización y la generación fiable de dauers. Sin embargo, no hay garantía de que una mutación particular daf-c no afectará a otros fenotipos-dauer específica solo o en combinación con mutaciones adicionales.

La presencia de una feromona dauer se implicó por primera vez por Cassada y Russell y más tarde demostró por Golden y Riddle. La feromona dauer desde entonces se ha caracterizado químicamente ^{2, 8, 9, 10.} La feromona purificada consiste en una mezcla compleja de ascarosides, que en diferentes formas a regular los procesos conductuales y de desarrollo ^{9, 11.} Uso de un extracto de feromona dauer crudo permite inducción fiable controlada de dauers sincronizados en un fondo de tipo salvaje. </p>

El sistema nervioso y las células gliales asociadas se someten a la remodelación durante dauer larva formación ^{12, 13, 14.} Algunos de estos cambios son irreversibles, tales como la remodelación de las células de la glia durante dauer ^{13, 14.} Sin embargo otros eventos de remodelación son reversibles en un retorno a la favorable condiciones ambientales. Por ejemplo, un conjunto de cuatro neuronas IL2Q se someten a la remodelación neuronal rápida y reversible durante la formación de dauer incluyendo: arborización dendrítica, un interruptor de una sola dendríticas a las neuronas y los axones multidendritic remodelación ^12. Los métodos de la presente memoria permiten la formación de imágenes in vivo fiable de la neuroplasticidad inducida por estrés en un organismo modelo. Los métodos presentados para la producción y las pruebas de feromona dauer crudo se describen anteriormente y compilados a partir de varias fuentes de ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

1. crudo Dauer Pheromone Producción Crecer OP50 E. coli a partir de una sola colonia O / N a 37 ° C mientras se agita en 100 ml de caldo LB a 200 rpm. NOTA: Este cultivo O / N se puede hacer con antelación y se almacena a 4 ° C. Crecer N2 C. elegans en junio 15 a 20 cm placas de Petri con agar NGM (ver receta en la Tabla 1) se sembró con 50 l de E. OP50 coli hasta que las bacterias se ha consumido casi por 19. Hacer 5x 250 ml de S medios …

Representative Results

La producción de resultados de feromonas dauer crudo en un líquido amarillo (Figura 1) que es tanto el calor como el frío estable. Alícuotas de feromona crudo se almacenan a -20 ° C indefinidamente sin pérdida evidente de la actividad. Después de la producción de feromona, un único bioensayo dosis-respuesta es suficiente para una estimación aproximada de la potencia. Sin embargo, para la mayoría de los experimentos es necesario repetir el bioensayo 2 – 3 veces y tomar un promedio de cada expe…

Discussion

Un examen de la neuroplasticidad-dauer específicos y otros cambios morfológicos dauer asociada requiere controlado y formación fiable de dauers ya sea a través de la mutación genética (es decir, mutantes, daf-c) o por la exposición de los animales de tipo salvaje de la feromona. Mientras que el uso de una mutación genética para inducir dauers es conveniente, puede confundir los resultados. Por lo tanto, los datos recogidos con mutaciones daf-c deben confirmarse posteriormente con animales de t…

Materials

N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 mL H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 mL of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 mL of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 mL. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 mL of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 mL, autoclaved), 2.5 mL of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 liter. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 mL of 1 M CaCl2, and 0.75 mL of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 mL of 0.513 M NaCl and 5 µL of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 mL culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 mL.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µL 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µL 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving