방사성 트레이서와 식물에 미네랄 영양 성분 및 독성 물질의 플럭스를 측정
Summary
In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.
Abstract
Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.
Introduction
영양분과 독성 물질의 흡수 및 유통 강하게 식물의 성장에 영향을 미친다. 따라서, 기본 전송 프로세스의 조사가 특히 영양 최적화 및 환경 스트레스의 문맥에서, 식물 생물학 연구 및 농업 과학 1,2의 주요 영역을 구성한다 (예를 들어, 염 스트레스, 암모늄 독성). 식물체에서 플럭스의 측정을위한 방법들 중 최고 상당히 1950 개발 된 방사성 동위 원소 추적자의 사용 오늘날 널리 사용가되고 (도 3 등 참조)이다. 이러한 MIFE (자속 추정 이온 미세 전극)과 SIET (스캔 이온 선택성 전극 기법), 및 사용과 같은 조직에서의 루트 매체 및 / 또는 축적 이온 선택성 진동 미소 전극의 사용으로부터 영양분 고갈의 측정과 같은 다른 방법 이온 – 선택적 형광 염료는 또한 널리 적용되지만, 네트 독감을 검출 할 수있는 능력에 제한이XES (즉, 유입과 유출의 차이). 방사성 동위 원소의 사용은, 다른 한편으로는, 연구원 동역학 매개 변수를 해결하는 데 사용될 수있는 단방향 플럭스를 분리 및 정량화하는 독특한 능력을 허용한다 (예를 들면, K M과 V 최대) 및 용량에 대한 통찰력을 제공 지학, 교통 시스템의 메커니즘 및 규제. 방사성 트레이서 만든 단방향 플럭스 측정은 반대 방향의 자속이 높은 조건에서 특히 유용하고, 세포 풀의 회전율은 4 급이다. 추적 동위 원소는 같은 원소의 다른 동위 원소의 배경에 대해 관찰되어 있기 때문에 또한, 추적자 방법 (아래, '토론'참조) 측정은 많은 다른 기술과는 달리, 상당히 높은 기질 농도에서 수행 할 수 있습니다.
여기서 우리는 단방향 및 N의 방사성 동위 원소 측정을위한 자세한 단계를 제공그대로 식물 등 미네랄 영양소의 플럭스 및 독성 물질. 중점 플럭스 칼륨 (K +)의 측정, 식물 영양소 (5), 암모니아 / 암모늄에 이루어집니다 (NH 3 / NH 4 +), 그러나, 예를 들어, 높은 농도 (에 존재하는 경우 독성이 다른 다량 영양소, 1 10 mM의) 2. 우리는 방사성 동위 원소 (42) K + (t 2 = 12.36 시간)과 13 NH 13분의 3 NH 4 + (t 2 = 9.98 분), 각각 모델 시스템 보리의 손상 모종 (Hordeum의 vulgare의의 L를 사용합니다 .), 두 가지 핵심 프로토콜의 설명 : 추적 유출 (CATE)으로 직접 유입 (DI) 및 compartmental 분석. 우리는이 문서가 단순히 각 프로토콜을 수행하는 데 필요한 단계를 설명합니다 처음부터주의해야한다. 각 기술의 적절한 계산과 이론에 대한 간단한 설명을 제공하지만, 자세한 아르 박람회의 배경과 이론은 주제 4,6-9에 대한 몇 가지 주요 기사에서 찾을 수 있습니다. 중요한 것은,이 프로토콜은 다른 영양소 / 독성 물질의 분석을 플럭스 광범위하게 양도 (예를 들어, 24 나 +, 22 나 +, 86 굽은 +, 13 NO 3 -) 및 다른 식물 종에 대한 몇 가지주의 사항이기는하지만 (아래 참조) . 우리는 또한 방사성 물질로 작업하는 모든 연구자가 기관의 이온화 방사선 안전 규제를 통해 제공 라이센스에 따라 작동해야 중요성을 강조한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위의 예에서 알 수 있듯이, 추적자 방법은 란타 영양소와 독성 물질의 단방향 플럭스를 측정 강력한 수단이다. 1 NH 3 유입 아마도 225 μmol의 g -1의 시간 -1, 초과에 도달 할 수 있음을 보여준다 가장 높은 선의의 횡단 자속 적 공장 시스템 13에보고 있지만 순 플럭스를 측정 한 경우 플럭스의 크기는 볼 수 없습니다. NH (3)의</s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400-mL glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1-mL pipette | Gilson | F144493 | |
| 10-mL pipette | Gilson | F144494 | |
| 1-mL pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10-mL pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
Referenzen
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