El aspecto más estudiado de la biocompatibilidad de los materiales compuestos dentales es su citotoxicidad 3D CLSM imágenes lapso de tiempo combinado con la cuantificación de la señal fluorescente permite la evaluación sensible del destino celular en el tiempo. Utilizando este método podría ser una herramienta eficaz para evaluar la cytocompatibility de composites dentales.
Es generalmente aceptado que la interacción in vitro de material celular en es un criterio útil en la evaluación de biocompatibilidad material dental. El objetivo de este estudio fue utilizar 3D CLSM tiempo de imagen confocal lapso para evaluar la biocompatibilidad in vitro de compuestos dentales. Este método proporciona una indicación exacta y sensible de la tasa de células viables en contacto con extractos de compuestos dentales. El ELS adicional baja contracción, un compuesto dental utilizado para la restauración directa, se ha tomado como ejemplo. En la evaluación in vitro se realizó en células de fibroblastos gingivales humanos en cultivo primario mediante la tinción de Live / Dead. Las imágenes se obtuvieron con el sistema biológico FV10i confocal invertido y analizados con el Software 3.1 FV10-ASW. Análisis de la imagen mostró una muy ligera citotoxicidad en presencia del compuesto de prueba después de 5 horas de lapso de tiempo. Una ligera disminución de la viabilidad celular se muestra en contacto con el compuesto de extractos compar probadoed con las células control. Los resultados pusieron de relieve el uso de 3D CLSM imágenes lapso de tiempo como un método sensible para evaluar cualitativa y cuantitativamente el comportamiento de biocompatibilidad de materiales compuestos dentales.
Una de las principales normas citadas en las recomendaciones de la ISO para definir biocompatibilidad es la ausencia de toxicidad de material a las células. Compuestos dentales a base de resina pueden liberar componentes de la matriz resinosa, que podría ser debido inicialmente a la polimerización parcial, y / o más tarde debido a procesos de degradación con el tiempo 1-4. Estos componentes liberados entrar en contacto con los tejidos orales y pueden tener varios inconvenientes como las reacciones de urticaria y mucosas 5, el desarrollo de las reacciones alérgicas y de hipersensibilidad en los pacientes 6, modificaciones de la morfología de fibroblastos gingivales y la reducción en la proteína colágeno de tipo I 7, de inmunosupresión o inmunoestimulación en mitógeno impulsada por la proliferación de los linfocitos T purificados y células de bazo 8 y el daño del ADN en los fibroblastos gingivales humanos primarios, lo que subraya su potencial genotóxico 9. Muchos parámetros pueden afectar la toxicidad compuesto dental, como la sombra de la composite, la luz de curado, la composición química del monómero de la resina, el relleno y el grado de conversión de 10 13. Desde potencial tóxico in vitro de materiales puede predecir en situaciones in vivo y podría ser comparado con situaciones clínicas por el estudio de algunas variables relevantes. La citotoxicidad de compuestos dentales y sus componentes han sido ampliamente evaluado utilizando sistemas de cultivo celular 14- 16.
Estos sistemas in vitro se han desarrollado para evaluar compuestos dental biocompatibilidad en términos de: crecimiento celular, y la apoptosis celular utilizando THP-1monocytes como las células 17, la citotoxicidad en fibroblastos gingivales humanos 18, el potencial inflamatorio en queratinocitos HaCaT como las células 2, la funcionalidad de células odontoblast- como 23 MDPC células 19, la reducción de los niveles de ARN total, y aumento significativo en la inducción de la apoptosis de queratinocitos gingival humano 20 yDaño en el ADN en fibroblastos gingivales y pulpa de células 21.
Diferentes metodologías se sugieren para investigar la biocompatibilidad de los materiales compuestos dentales. Ensayos colorimétricos, que implican colorantes específicos y medidas de adsorción de luz, siguen siendo los más utilizados, debido a su relativa simplicidad y bajo costo 22- 26. Análisis de Microscopía de contraste de luz con frecuencia consume más tiempo e incurre en mayores costos. Sin embargo, estas técnicas de microscopía tienen algunas ventajas importantes. La observación de la estructura celular proporciona información ampliada sobre los efectos tóxicos experimentados, proporcionando así datos más relevantes y sensibles. En particular, la introducción de la microscopía confocal 27 ha permitido para la observación de estructuras biológicas con la mejora de la resolución axial en comparación con el de campo amplio tradicionales microscopios de fluorescencia de imágenes. Por lo tanto, la imagen confocal se ha convertido en una poderosa herramienta de investigación en diferentes campos de lainvestigaciones médicas y científicas. En contraste con las técnicas de microscopía electrónica, microscopía de barrido confocal ofrece la capacidad de visualizar los distintos componentes de las células mediante la incorporación de marcadores fluorescentes específicos. La mayoría de estos trazadores específicos son estables en un entorno acuoso, sensiblemente medible, barato y no tóxico 28, lo que permite su uso en clínica, así como los estudios de investigación de laboratorio. Por otra parte, el secado y fijación de muestras requerido para el análisis de microscopía electrónica convencional no es necesaria para la formación de imágenes confocal lapso de tiempo, la adquisición de este modo dependiente del tiempo también es posible en muestras. En comparación con la formación de imágenes de dos dimensiones, el principio de formación de imágenes confocal permite una visualización del subsuelo muestra y la estructura tridimensional de reconstrucción de las diferentes imágenes de profundidad obtenidos; detalles que dan como resultado, más precisos y más estructurales 29, 30. El presente estudio de vídeo es un ejemplo de la utilización de tres dimensiones de intervalos de tiempo Confocal Laser Scanning Microscopy (3D-CLSM) combinada con etiquetado Live / Dead fluorescente y la cuantificación de la señal como un método innovador. La técnica presentada en este documento tiene la ventaja de permitir la evaluación y el lapso de tiempo sensible de imágenes de células vivas sin cambiar la estructura de la célula evaluado. No se requieren pasos de preparación antes del análisis confocal. Anteriormente, la misma tinción se utilizó para evaluar la viabilidad del cultivo núcleos de hueso esponjoso 31 pero sin confocal de lapso de tiempo siguiente. Del mismo modo se utilizó el mismo procedimiento confocal de lapso de tiempo para evaluar la actividad de letalidad eritromicina en las bacterias de lodos activados de acuerdo a su tipo de Gram 32 utilizando una bacteria específica Vivir / tinción muertos. Estos métodos se han adaptado y utilizado para comparar la toxicidad de compuestos dentales basados en monómeros de metacrilato de 11 recientemente.
Comportamiento del material biocompatibilidad es el parámetro más requisito previo para ser evaluados antes de su uso médico. Las normas internacionales cubren los dispositivos médicos ISO 10993 33 y específicamente los materiales dentales ISO 7405 34. La ausencia de los efectos tóxicos a las células circundantes es la norma fundamental en la evaluación de la biocompatibilidad de estos materiales. Es por eso que las pruebas de citotoxicidad tiene tal importancia en la evaluación de la biocompatibilidad material dental 35-37. La ISO sugirió métodos de prueba podrían basarse en la actividad metabólica o integridad de la membrana. Puntos finales seleccionados deben seguir condiciones específicas para la clasificación de efectos adversos inducidos por un material de ensayo con el fin de minimizar el tiempo y el costo de los ensayos de evaluación. El método actual de investigación (imágenes por lapso de tiempo confocal 3D) es la integridad de la membrana basada. La evaluación de la citotoxicidad a través de este punto final parece ser un valioso marcador de biocompa celulartibilidad con materiales probados y que es también la ISO aprobó punto final. In vitro pruebas están diseñadas para determinar cómo una muestra de material afecta a un tipo de célula particular. El ensayo colorimétrico MTT fue descrito originalmente por Mossman (1983) como un método útil para la medición de la citotoxicidad in vitro y la proliferación celular. La prueba de MTT se basa en la conversión de la sal de tetrazolio en cristales de formazán por las células activas, que determina la actividad mitocondrial. Esto se puede traducir por bajos viabilidad 38. Gupta y colaboradores informaron de que la prueba de MTT es el método más ampliamente utilizado para medir la citotoxicidad de las resinas compuestas. Deshidrogenasa succínico y respuestas de fosfatasa alcalina también se han utilizado para el mismo propósito 39. Sin embargo, las células de destino no puede ser objeto de seguimiento, puesto que el ensayo de MTT requiere matar las células en cada punto de tiempo de medición. Con el fin de seguir más de cerca el comportamiento de las células teñidas en el estudio actual, diSe llevó a cabo la observación de células vivas rect, gracias a imágenes CLSM lapso de tiempo combinado con una tinción protocolo corto, análisis de imágenes automatizado y cuantificación de la señal fluorescente.
Materiales compuestos dentales vienen en estrecho contacto con los tejidos orales, especialmente células de la encía y la pulpa. Los fibroblastos serían el blanco de los componentes liberados de estos compuestos restauradores 40-41. Además, varios estudios han informado de que las células inmortalizadas y células primarias pueden tener diferentes respuestas celulares en contacto con biomateriales. Se encontraron células primarias para ser más apropiada para evaluar los efectos biomateriales 42. Esto explica el uso de células de fibroblastos gingivales humanos primarios como modelo de células para la evaluación de la citotoxicidad del material compuesto dental probada en el estudio actual. El potencial toxicidad de las sustancias liberadas a partir de composite dental ha sido ampliamente estudiado 43-44. A fin de evaluar tél potencial citotóxico de los materiales, dos células modelo de contacto se podrían realizar. En el sistema modelo de contacto directo el material se coloca directamente con las células diana, mientras que en el sistema de contacto indirecto, las células diana están en contacto con eluye de medios biológicos. En las aplicaciones clínicas y para los procedimientos de restauración, compuesto dental se colocan en contacto indirecto con los tejidos gingivales. Por esta razón, el protocolo experimental actual se centra en el sistema de contacto indirecto con fibroblastos gingivales humanos (células en presencia de los extractos compuestos ensayados). Como se informó anteriormente por Dahl y colaboradores, las respuestas de citotoxicidad se clasificaron como graves (<30%), moderada (30-60%), leve (60-90%) o no citotóxico (> 90%), basado en la actividad relativa a los valores obtenidos para los controles 45. Por lo tanto, según este ranking, ya la luz de los resultados obtenidos (Tabla 1), compuesto ELS adicional baja contracción podría ser clasificado como very ligeramente citotóxica y mostró un comportamiento comparable con las células control durante todo el período de lapso de tiempo. Utilizando el mismo método de investigación, precisamente, los resultados de este estudio podrían ser comparados con los de un estudio recientemente publicado. El extra de compuesto de baja contracción ELS demostró la biocompatibilidad superior en comparación con los dos compuestos ensayados previamente utilizados para la misma aplicación clínica que es la restauración directa 11. Otros estudios son aún necesarios para establecer una comparación más completa.
Al decidir que la citotoxicidad de ensayo para aprobar una evaluación específica de punto final, es importante entender las ventajas y las limitaciones de cada ensayo. El propósito principal de formación de imágenes confocal es lograr una arquitectura de 3-D de las células y órganos. La técnica es capaz de revelar no sólo la superficie de una muestra, sino también su subsuelo. El protocolo se describe en este documento pone de relieve el uso de 3D CLSM tiempo de imagen confocal lapso, como sensitiva método para evaluar el comportamiento de biocompatibilidad in vitro de un material compuesto dental. Sin embargo, a fin de evitar las limitaciones encontradas en este trabajo, estaciones de trabajo anti-vibración podrían ser utilizados con el fin de permitir que la imagen más estable y más largo lapso de tiempo; el tablero de la mesa podría aislar el sistema confocal utilizado por los efectos perjudiciales que las vibraciones en el laboratorio pueden causar. Además, los materiales que se utilizarán en la cavidad oral idealmente debería ser inocuo para los tejidos gingivales y no deben contener sustancias que podrían causar toxicidad sistémica. De acuerdo con la metodología utilizada y los resultados obtenidos en el presente estudio se puede concluir que el compuesto probado (ELS adicional baja contracción) no es citotóxica en las presentes condiciones experimentales. Como el método MBRC sensibilidad puede dar la velocidad inicial de células viables, otras posibilidades podrían preverse para evaluar más puntos finales. En particular, como se ha informado recientemente que los monómeros compuestos afectan a las células thrOugh especies reactivas de oxígeno (ROS) 46- 48, se necesita más investigación para evaluar si los hay correlaciones entre la citotoxicidad redes y la producción de ROS señalización. El futuro protocolo podría ser diseñado para evaluar simultáneamente la producción de ROS (H 2 O 2 y / o O 2 – tinción) y la relación de la citotoxicidad (tinción en vivo / muerto) utilizando imágenes CLSM lapso de tiempo.
The authors have nothing to disclose.
Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.
Olympus Fluoview FV10i | Olympus | Confocal microscope | |
O2/Co2 Incubator | Pnasonic | MCO 5M | Cell incubation |
Live/Dead® Kit | Invitrogen | MP 03224 | Stain |
ELS extra low shrinkage® | Saremco | Dental composite | |
DMEM medium | Sigma | D 6046 | Culture medium |
Trypsin | Sigma | T1426 | harvesting cells |
chamber slide system | PAA | 14220040X | Culture chamber |
penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | Cell culture |
Amphotericin B | PAA | P11-001 | Cell culture |
Foetal bovine serum | PAA | A11-101 | Cell culture |
Cell Counter | Merck Millipore | 00110230TP1 | Cell counting |