Crear anatómicamente exactos y reproducibles intracraneal xenoinjertos de tumores cerebrales humanos
Summary
El cerebro es un sitio único con cualidades que no están bien representados por los análisis in vitro o ectópicos. Modelos ortotópico de ratón con la ubicación y características de crecimiento reproducibles se pueden crear de forma fiable con inyecciones intracraneales utilizando un instrumento de fijación estereotáxica y una bomba de inyección de baja presión.
Abstract
Modelos de tumores ortotópico Actualmente la mejor manera de estudiar las características de un tipo de tumor, con o sin la intervención, en el contexto de un animal vivo – sobre todo en lugares con cualidades fisiológicas y arquitectónicos únicos, como el cerebro in vitro y modelos ectópicos no pueden. dar cuenta de las características tales como la vasculatura, la barrera de sangre del cerebro, el metabolismo, la administración de fármacos y toxicidad, y una serie de otros factores pertinentes. Ortotópico modelos tienen sus limitaciones también, pero con células tumorales técnica apropiada de interés pueden ser injertados con precisión en el tejido que más estrechamente imita las condiciones en el cerebro humano. Por métodos que proporcionan volúmenes medidos con precisión a definido con precisión lugares a una velocidad y presión constante, modelos de ratón de tumores cerebrales humanos con tasas de crecimiento predecibles se pueden crear de forma reproducible y son adecuados para el análisis fiable de las diversas intervenciones empleando. El protocolo aquí descrito se centra en el TEdetalles chnical de diseño y preparación para una inyección intracraneal, la realización de la cirugía, y garantizar el crecimiento tumoral exitosa y reproducible y proporciona puntos de partida para una variedad de condiciones que se pueden personalizar para una gama de diferentes modelos de tumor cerebral.
Introduction
Estudios in vitro de células tumorales cerebrales son de incalculable valor para la disección de los mecanismos moleculares que impulsan el crecimiento, la supervivencia, la migración y la invasión de las células cancerosas; experimentos de células cultivadas pueden definir las vías de señalización, sugerir posibles dianas terapéuticas, y caracterizar la respuesta celular al tratamiento farmacológico. Pero in vitro sistemas son demasiado simplistas para predecir la respuesta del organismo a los productos farmacéuticos; que carecen de las reacciones fisiológicas, respuestas inmunes, microambiente celular, y heterogeneidad general de los sistemas de animal vivo. Genéticamente modelos de ingeniería puede ser muy valiosa, cuando esté disponible, pero existen diferencias moleculares entre las especies y de las células murinas pueden no recapitular los acontecimientos en los procesos humanos, dando lugar a discrepancias significativas al comparar los modelos animales a observación clínica 1. Modelos de xenoinjertos en ratones consistente (SQ) inyección subcutánea de líneas celulares de tumores cerebrales humanos bajo la piel del flanco son fáciles de realizary medir; que se pueden usar para abordar los efectos de la modificación genética y la administración del fármaco / entrega, el metabolismo y la toxicidad. Inconvenientes significativos, sin embargo, limitan la utilidad de los modelos SQ. El microambiente no recapitula la de un tumor cerebral de origen natural: las interacciones de los diversos tipos de células y tejidos; la vasculatura local y otros innumerables factores única para el cerebro no se pueden replicar. Para reproducir con mayor precisión el medio único de un tumor cerebral de origen natural y probar los efectos de las intervenciones farmacéuticas, un modelo ortotópico de ratón debe ser utilizado. Además, las técnicas ortotópico se pueden utilizar como parte de un enfoque de ingeniería genética en el que las células no cancerosas humanas primarias (diferenciado o progenitor) son modificadas genéticamente y se inyecta en el sitio correspondiente de un ratón, con o sin células del estroma humanos, lo que resulta en la tumorigénesis similar a la observada en los seres humanos 1.
En este artículo se describeuna metodología para crear con precisión y de manera reproducible tumores cerebrales en ratones. Usando esta técnica, el usuario puede inyectar con precisión una pequeña alícuota de células suspendidas en una ubicación especificada de la región fronto-parieto-temporal de la corteza cerebral de ratón. Mortalidad Mouse es extremadamente baja; en nuestras manos, no hay ratones han muerto a causa de complicaciones quirúrgicas después de 185 procedimientos. Características del tumor resultante se pueden comparar con la de los tumores clínicos humanos típicos; por ejemplo: la rapidez de crecimiento, grado de necrosis, extensión de la invasión, la heterogeneidad del tipo de células, la presencia de células mitóticas, marcadores de proliferación y apoptosis, etc líneas celulares o muestras de tejido o desagregados tumorales humanas pueden ser evaluados en base a su capacidad para simular presentación clínica real. Pharmaceuticals, seleccionados en base a su rendimiento en el cultivo de células, se puede probar en el contexto de un metabolismo funcionamiento, el sistema circulatorio, y la barrera sangre-cerebro, tal como existen en un ingenio de los animales cargadosha tumor, todo en un contexto arquitectónico relevante. Además, las células elegidas para inyección se pueden modificar genéticamente para investigar el impacto de caídas específicas, deleciones, knock-ins, mutaciones, etc, sobre el crecimiento del tumor y la supervivencia.
Un número de publicaciones de documentos de estudios de tumores utilizando una variedad de técnicas intracraneales. Yamada et al. Hizo un estudio detallado de la inyección de colorante y de las células U87 y se encontró que la minimización del volumen y la tasa de inyección produce la mejor tumor 2. . Brooks et al encontró superior reproducibilidad y la eficiencia utilizando un inyector controlado por microprocesador en lugar de un método manual para entregar vectores virales; sus conclusiones con respecto a los parámetros óptimos de inyección son aplicables a la entrega de 3 celdas. Shankavaram et al. Demostraron que con glioblastoma multiforme (GBM) líneas de células inyectadas ortotópicamente (usando un método manual) en el cerebro recapituló el perfil de expresión génica de la cltumores inical más estrechamente que sea en xenoinjertos in vitro o SQ, que apoya el uso de modelos intracraneales para estudios preclínicos 4. Giannini et al. Células de especímenes quirúrgicos humanos que habían sido sostenidas en los flancos de ratones desnudos por pases seriados en los cerebros de los ratones inyectados adicionales, y demostró que este enfoque conserva pacientes alteraciones genéticas del tumor en el modelo 5. Resultados similares fueron reportados por Yi et al 6. Uso de una configuración estereotáxica, sitio de la inyección cuidadosamente definido, y una velocidad de inyección lenta y constante, se obtuvieron tumores cerebrales reproducibles con tasas de crecimiento consistente y de alta (100%) Tasa de injerto. La validez de esta técnica, por lo tanto ha sido bien establecida; una búsqueda en la literatura sugiere que las aplicaciones de esta técnica son extensas. Carty et al. Utiliza inyecciones intracraneales para entregar con éxito vectores virales que expresan genes terapéuticos en la corteza frontal de transgenic modelo de la enfermedad de Alzheimer 7. Thaci et al. Describe el uso de inyecciones intracraneales para entregar adenovirus oncolítico terapéutico en un vehículo basado en células madre neuronales en ratones desnudos que llevan ya ortotópicamente tumores inyectados GBM 8. Claramente, las inyecciones intracraneales son una herramienta versátil y eficaz para la investigación preclínica. Publicaciones anteriores en el Diario de los experimentos visualizados describen enfoques fundamentales 9-11, pero tomamos el concepto de la inyección del tumor intracraneal y modelado ortotópico a un nivel más alto de precisión usando tecnología fácil de dominar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelos ortotópico de ratón de cáncer del cerebro humano puede ser una excelente herramienta para evaluar la eficacia de las terapias clínicas, pero se debe tener cuidado para optimizar la colocación de las células en el tejido cerebral. Los estudios han demostrado que los volúmenes alícuotas excesivas, técnica de inyección subóptima y las tasas de inyección precipitadas pueden conducir a la permeabilidad y la aparición de células tumorales en lugares no deseados (ventrículos, la médula espinal, las regi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Keating es financiado por CA100335 subvención del Departamento de Defensa y es una de St. Baldrick becario de la Fundación.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console. | Kopf | Model 940 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | |
| Mouse Ear Bars | Kopf | Medel 922 | |
| Fiber Optic Illuminator | Fisher | 12-562-36 | |
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 microprocessor | WPI | UMC4 | |
| Variable speed hand-held rotary drill | Dremel | Model 300 | |
| Dental drill bit, 1.0 mm | Spoelting | 514554 | |
| Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet | Dremel | 481 | |
| Heating pad | for mice | ||
| Isoflurane vaporizer system | for mice | ||
| Medical tubing and connectors | to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame | ||
| Instruments | |||
| Precision 25 ul micro syringe | Hamilton | 7636-01 | Model 702, without needle |
| Microsyringe needles, 26s gauge | Hamilton | 7804-04 | RN, 25 mm point style 2 |
| Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp) | |||
| Medium-sized standard scissors | |||
| Standard serrated forceps | |||
| Serrated hemostats (2) | |||
| Fine-tipped forceps | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| Surgical blades #10, stainless (Feather) | Fisher | 296#10 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | NDC 13985-528-60 | Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/mL) | Pfizer | NDC 61106-8507-01 | dilute in saline |
| Ophthalmic ointment (artificial tears) | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Topical antibiotic (AK-Poly-Bac ) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine) | Betadine | NDC 67618-150-04 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | for visualizing skull landmarks |
| Sterile saline | VetOne | NDC 13985-807-25 | for diluting solutions, cleaning tissue |
| Bone wax | WPI | Item #501771 | |
| Sterile drapes | McKesson | 25-517 | |
| Sterile surgical gloves | McKesson | (to fit) | |
| Sterile gauze pads, 2 x 2 | Fisherbrand | 22028556 | |
| Sterile gauze pads, 4 x 4 | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Alcohol prep pads (medium) | PDI | B603 | |
| Sterile cotton-tipped applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | |
| Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells | USA Scientific | 1405-4700 | for cells |
| Individually wrapped sterile dispo pipettes | Fisher | BD 357575 | for needle cleaning solutions |
| BD insulin syringes with needles | Fisher | 329461 | for analgesic |
| 70% ethanol | for cleaning | ||
| Sterile di H2O | for cleaning | ||
| Microfuge tubes for cleaning solutions | for needle cleaning solutions | ||
| Felt tip pen (dedicated) | for marking skull |
Referenzen
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
- Yamada, S., et al. A method to accurately inject tumor cells into the caudate/putamen nuclei of the mouse brain. The Tokai journal of experimental and clinical medicine. 29, 167-173 (2004).
- Brooks, A. I., et al. Reproducible and efficient murine CNS gene delivery using a microprocessor-controlled injector. Journal of neuroscience. 80, 137-147 (1998).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. Journal of cellular and molecular medicine. 16, 545-554 (2012).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro-oncology. 7, 164-176 (2005).
- Yi, D., Hua, T. X., Lin, H. Y. EGFR gene overexpression retained in an invasive xenograft model by solid orthotopic transplantation of human glioblastoma multiforme into nude mice. Cancer investigation. 29, 229-239 (2011).
- Carty, N., et al. Intracranial injection of AAV expressing NEP but not IDE reduces amyloid pathology in APP+PS1 transgenic mice. PLos ONE. 8, e59626 (2013).
- Thaci, B., et al. Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model. Cancer gene therapy. 19, 431-442 (2012).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Valadez, J. G., Sarangi, A., Lundberg, C. J., Cooper, M. K. Primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase I mutation. J. Vis. Exp. (83), (2014).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- Iwami, K., et al. A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models. Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).
