Metodi per cellulari-attached Misure di capacità in mouse surrenale cromaffini cellulare

Summary

After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

Abstract

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.

Introduction

Trasmissione sinaptica è mediata da esocitosi delle vescicole sinaptiche, contenenti neurotrasmettitori, e queste vescicole deve subire riciclaggio endocitica locale all'interno del nervo terminale per mantenere la comunicazione neuronale a lungo termine. Dato il ruolo essenziale della trasmissione sinaptica nel cervello, la comprensione del macchinario molecolare che costituisce il ciclo delle vescicole sinaptiche è un fondamento essenziale verso una migliore comprensione nella comunicazione cellulare nel suo complesso. Tra sistemi modello delle cellule, la cellula cromaffini surrenale ha fornito alcune delle l'intuizione più definitiva nel meccanismo molecolare alla base riciclo delle vescicole sinaptiche. Esocitosi, la fase finale di rilascio di neurotrasmettitore, è stato immensamente studiata ed esaminata attraverso l'uso della cella cromaffini surrenale ^1,2. In realtà, la maggior parte dei giocatori molecolari che orchestrano la formazione, il targeting, attracco, e la fusione dei granuli secretori sono stati identificati grazie alla applicazione di divtecniche di Erse nelle cellule cromaffini ^1. Inoltre, fornendo l'opportunità di consentire la risoluzione di una singola vescicola dei macchinari proteina coinvolta nella esocitosi, la cella cromaffini rimane un modello potente per affrontare le questioni della fusione delle vescicole ^3.

Misure di capacità cellulari iscritti sono stati utilizzati nella risoluzione di singolo-fusione delle vescicole durante esocitosi ^3. Esocitosi di vescicole piccole come ~ 60 nm di diametro è stato dimostrato di essere rilevato da membrana cellulare misurazioni ammissione con la tecnica del patch clamp in configurazione cell allegato ^4-7. Accettazione è definita come una misura di quanto facilmente un circuito o un dispositivo consentirà una corrente di flusso; è l'inverso di impedenza. Pertanto, le misure di ammissione forniscono una comprensione della capacità di membrana. Questo si ottiene l'incorporazione della membrana vescicolare nella membrana plasmatica; questa incorporazione rivela cambiamenti di superficiezona ^8. Ogni vescicola fusione provoca un aumento graduale di capacità di membrana ^9,10. Inoltre, questa misura ammettenza fornisce la conduttanza della membrana e la fusione dei pori conduttanza durante un evento esocitotico ^3. Poiché questa tecnica ha fornito uno strumento unico di identificare cinetica singoli-vescicole durante esocitosi, il nostro laboratorio ha recentemente applicato questo concetto per rilevare endocitosi di singole vescicole ^11,12.

Il nostro interesse specifico è clatrina-mediata endocitosi (CME), che è stato considerato come una componente fondamentale di pulizia in molte cellule ¹³ e come via principale per endocitosi delle vescicole sinaptiche nei terminali neuronali ^14,15. CME è conosciuto per essere biologicamente importante, tuttavia, la sua cinetica non restino ben capito a causa di limitazioni tecniche di monitoraggio degli eventi endocitiche singolari. Date le somiglianze nei meccanismi di esocitosi tra le cellule cromaffini e neuroni ^1, è plausible che i meccanismi di fissione nelle cellule cromaffini può probabilmente applicarsi a endocitosi delle vescicole sinaptiche nei neuroni. Le misure di capacità di cella-attached sono stati utilizzati per monitorare singoli eventi endocitiche e analizzare la cinetica di fissione, che la maggior parte dei metodi non sono in grado di risolvere. Nelle nostre registrazioni cellulari-attached, un'onda sinusoidale a 20 kHz si trova sopra il potenziale di detenzione, e la corrente di uscita è suddiviso in membrana conduttanza in un canale e capacità di membrana in un altro canale da una a due fasi amplificatore lock-in ^{16 18.} Dai cambiamenti nella conduttanza di membrana e capacità, si può calcolare la cinetica di fissione poro, che probabilmente corrispondente al collo membrana tubolare che collega la vescicola internalizzazione alla membrana plasmatica prima vescicola pinch-off. Collettivamente, questa tecnica ci dà l'opportunità di esaminare i meccanismi regolatori della vescicola fissione durante CME.

Protocol

NOTA: L'intera procedura è stata condotta in conformità con le linee guida del National Institutes of Health, come approvato dalla cura e uso degli animali Comitato della University of Illinois a Chicago. 1. Soluzioni e Media Cultura Preparati Conservare tutte le soluzioni a -20 ° C per un massimo di sei mesi. Tenere il terreno di coltura a 4 ° C per un massimo di 3 mesi. Preparare 100 ml di coltura mescolando 1 ml di soluzione di pen-strep e 1 ml di ITSX (Insuli…

Representative Results

La vitalità delle cellule e la qualità di tenuta gigaohm sono critici nel determinare la qualità delle registrazioni capacità della cella collegata. Pertanto, è fondamentale per procurare un coltura cellulare efficace ed efficiente prima di registrazioni elettrofisiologiche, e le cellule vitali tipiche sono illustrate nella figura 1. Practice e il tempo sarà utile nel raggiungimento di un sigillo gigaohm con alta qualità. Se si può vedere chiaramente deformazione cella quando la pipetta di patch…

Discussion

Misure di capacità cellulari iscritti richiedono diversi passaggi critici al fine di ottenere con successo le registrazioni di alta qualità: 1) cellule vitali e sane preparate dalle ghiandole surrenali; 2) il rivestimento PDL dei coprioggetto; 3) formazione sigillo gigaohm; 4) livello di rumore del sistema; e 5) correzione di fase.

Per la chirurgia animali, le modifiche si può potenzialmente fare è quello di regolare l'approccio chirurgico al meglio destrezza vestito e per evitare da…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100mL
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Only thaw on ICE!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 data acquisition board	National Instruments
Igor data acquisition software	Wavemetrics
P-97 pipette puller	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	B150-110-10	Outer diameter-1.5 mm
			Inner diameter 1.10 mm
			Length- 10 cm