Charakterisierung der Zusammensetzung der molekulare Motoren auf Umzug Axonal Fracht Mit "Fracht Mapping" Analysis
Summary
Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.
Abstract
Das Verständnis der Mechanismen, mit denen molekulare Motoren koordinieren ihre Aktivitäten, um vesikuläre Ladungen innerhalb Neuronen transportieren erfordert die quantitative Analyse von Motor / Frachtverbände an der einzelnen Vesikel Ebene. Das Ziel dieses Protokolls ist es, quantitative Fluoreszenzmikroskopie, um die Zusammensetzung und die relativen Mengen von Motoren mit der gleichen Ware zusammen verwenden, um zu korrelieren ("Karte") die Position und Ausrichtung der Verbringung von lebenden Fracht. "Fracht Mapping" besteht aus Live-Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Ladungen bewegt sich in Axonen auf mikrofluidischen Systemen kultiviert, gefolgt von chemischen Fixierung während der Aufzeichnung von Live-Bewegung, und anschließende Immunfluoreszenz (IF) Färbung der exakt gleichen axonalen Regionen mit Antikörpern gegen Motoren. Kolokalisation von Ladungen und dazugehörigen Motoren wird durch Zuweisen Teilpixelposition beurteilt Koordinaten Motor und Ladekanäle, durch Einpassen Gauß-Funktionen, um den beugungs ligrenzten Punktbildfunktionen, die einzelne fluoreszierende Punktquellen. Feste Ladung und Motor Bilder werden anschließend auf Parzellen von Frachtbewegung überlagert, um "Karte", dass sie ihr verfolgten Trajektorien. Die Stärke dieses Protokolls ist die Kombination von lebenden und IF-Daten, sowohl den Transport von vesikulären Ladungen in lebenden Zellen zu erfassen und um die Motoren zu diesen gleichen Vesikel assoziiert bestimmen. Diese Technik überwindet früheren Herausforderungen, die biochemischen Methoden verwenden, um die durchschnittliche Motor Zusammensetzung gereinigt heterogenen Groß Vesikelpopulationen bestimmen, wie diese Methoden nicht Kompositionen auf einzelnen, sich bewegenden Ladungen offenbaren. Ferner kann dieses Protokoll für die Analyse von anderen Transport- und / oder Transportwege in anderen Zelltypen geeignet ist, die Bewegung der einzelnen intrazelluläre Strukturen mit ihrer Proteinzusammensetzung zu korrelieren. Einschränkungen dieses Protokolls sind die relativ geringen Durchsatz aufgrund der geringen Transfektionseffizienz kultivierterprimären Neuronen und eine begrenzte Sichtfeld für hochauflösende Abbildungs erhältlich. Zukünftige Anwendungen könnten Verfahren umfassen, die Anzahl der Neuronen, die fluoreszierend markierten Ladungen zu erhöhen.
Introduction
Intrazellulären Transport ist kritisch bei allen Zelltypen für die Abgabe von Proteinen, Membranen, Organellen und Signalmolekülen zu verschiedenen zellulären Domänen 1. Neuronen sind hoch spezialisierte Zellen, die mit langen, polarisierten Projektionen, die sich kritisch auf den intrazellulären Transport von essentiellen Güter für ihre Langstrecken Lieferung an verschiedenen axonalen Mikrodomänen abhängen. Zwei große Familien von molekularen Motorproteinen – – Dieser Transport wird durch Kinesinen und Dyneine vermittelte, dass bind zu Ladungen und verfolgen zusammen polarisiert Mikrotubuli in anterograde und retrograder Richtung. Während Rückwärtsbewegung wird hauptsächlich durch Dynein vermittelt, wird die Bewegung in der anterograde Richtung von einem großen, funktionell vielfältige Familie von Kinesin-Motoren erleichtert. Folglich konnte anterograde Transport von axonalen Ladungen von verschiedenen Familienmitglieder der Kinesin-Superfamilie 1-5 vermittelt werden. Obwohl einige Ladungen bewegen beharrlich in jeder Richtung, most Ladungen bewegen bidirektional und Rückwärts häufig auf ihrem Weg zu ihrem endgültigen Ziel 1,5-13. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Motoren gleichzeitig gegenüberliegenden Richtungs assoziieren Ladungen, was die Frage aufwirft, wie geregelten Bewegung der Ladungen von entgegengesetzter Polarität Motoren 5-7 koordiniert. Gemeinsam ist den Transport von Axonen Ladungen eine abgestimmte Prozess, der von der Zusammensetzung der Motoren und ihrer spezifischen biochemischen Aktivitäten, die wiederum abhängig von verschiedenen Adaptern und regulatorische Bindungspartner 14 reguliert wird.
Um beschreiben zuverlässig den Mechanismus der axonalen Transport für eine bestimmte Ladung und die zugrunde liegende Regelung dieser Transport aufzudecken, ist es von größter Bedeutung, um die Zusammensetzung der Motorproteine und deren Regulierungsbindungspartner mit individuellen Ladungen bei ihren Live-Verkehr verbundenen bestimmen. Andere Methoden, zum Beispiel biochemische Ansätze liefern Schätzungen des durchschnittlichen motoder Zusammensetzungen auf gereinigten heterogenen Vesikelpopulationen, aber diese Schätzungen enthüllen nicht die Art oder die Menge der Motoren, um einzelne bewegenden Vesikeln assoziiert. Auch Rekonstitution Vesikeltransportstudien entlang vormontierten Mikrotubuli in vitro aktiviert Messen der Menge von einem Motortyp auf einem Vesikel Stufe 15. Jedoch haben diese Versuche nicht direkt korreliert die Menge der Motoren mit den Transporteigenschaften dieser Vesikel und gemessenen Verkehrs in Abwesenheit von zellulären regulatorischen Faktoren.
Ein Protokoll wird hier vorgestellt, die den Motor Zusammensetzung (Art und relative Menge der Motoren) der einzelnen beweglichen Vesikel aus Immunfluoreszenz (IF) Datenmess endogen exprimierten Motorproteine bestimmt, und korreliert diese Parameter, um die Live-Transport von der exakt gleichen Vesikel in Nervenzellen 16. Dieses Verfahren beinhaltet eine präzise Abbildung der IF-to-live Frachtbewegungsdaten. Dies wird bewerkstelligt Growing Hippocampus-Neuronen der Maus in mikrofluidischen Geräte folgen etablierten Protokollen 17-19. Diese Geräte ermöglichen die Identifizierung und Korrelation ("Mapping") von Axonen und Einzel bewegten Ladungen in festen und Live-Lichtmikroskopie Modalitäten (Abbildung 1). Kultivierten Neuronen werden mit fluoreszenzmarkierten Fracht Proteine, deren Transport mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung abgebildet werden, um detaillierte Bewegungsinformationen, die in Kymographen aufgetragen wird erhalten transfiziert. Im Verlauf der Bilderzeugung werden Neuronen, die mit Paraformaldehyd fixiert und anschließend mit Antikörpern gegen endogene Motorproteine angefärbt. Feste Fracht und Kraftbilder auf Live-Bewegung Kymographen lagert, um "Karte" (colokalisieren) sie an den Live-Fracht Bewegungstrajektorien 16. Um die Live-Bewegung der Ladungen mit dem Verband der Motorproteine korrelieren, wird Kolokalisation mit einem maßgeschneiderten MATLAB Software-Paket namens "Mo analysierttor Kolokalisation "16,20. Fluoreszenzmarkierten Ladungen und Motoren erzeugen beugungsbegrenzten punktförmige Merkmale, die teilweise überlappen können. Um die Position des überlappenden puncta zu beheben, zuerst passt die Software automatisch Gauß-Funktionen zu jedem Punktverwaschungsfunktion, die einzelne fluoreszierende Pünktchen, um ihre genaue XY Subpixel-Positionskoordinaten und Intensität Amplituden 21-23. Die Positionen der Motoren und der Ladungen sind anschließend miteinander verglichen, um zu bestimmen Kolokalisation 16,20. Daher wird dieses Verfahren genauer ordnet Kolokalisation von Fluoreszenzpünktchen im Vergleich zu anderen Verfahren 24.
Die Stärke dieser Methode ist die Möglichkeit, die Kolokalisation von Motoren mit einzelnen Lade in fixierten Zellen zu beurteilen, für die Live-Bewegungsbahnen (beispielsweise die Richtung, in der sie zum Zeitpunkt der Fixierung bewegt) wurden recorded. Mit diesem Verfahren wurden kinesins und Dyneine Ergebnis gleichzeitig an Vesikeln, die die normale Prionprotein tragen (PrP C -cellular), eine neuronal angereicherten Ladung, die in zwei Richtungen bewegt oder stationär bleibt in Axonen 16 zuzuordnen. Diese Analyse erlaubt die Formulierung eines Arbeitsmodells für die Regulierung von PrP C Vesikel Bewegung, in der anterograde (Kinesin) und retrograde (Dynein) Motoren koordinieren ihre Aktivitäten, um die Vesikel in jeder Richtung bewegen oder stationär zu bleiben, während auf die Ware zusammen . Eine weitere Stärke dieser Methode ist, sein Potenzial breite Anwendbarkeit zur Charakterisierung Kolokalisation / Verband vieler fluoreszenzmarkierten Ladungen, die in praktisch jeder Zelltyp zu bewegen, mit einem anderen Protein (e) von Interesse. Somit könnte live / feste Zuordnung potentiell für den Nachweis von transienten Protein-Interaktionen Ladung zu ermöglichen, können so viele einzelne fluoreszenzmarkierten bewegenden Teilchen über einen gewünschten p analysierendeEITRAUM der Zeit. Angesichts der breiten Anwendbarkeit und die Art der Fragen, die diese Methode ansprechen können, wird dieses Protokoll von Interesse für ein breites Publikum von Zellbiologen einschließlich derjenigen studieren Handel und Transport in Neuronen oder in anderen Zelltypen sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Korrelation der Direktionalität der Bewegung der einzelnen fluoreszierenden Mikrotubuli-basierte Bewegen der Fracht Teilchen mit der relativen Art und Menge der zugeordnete Motor-Proteine in lebenden Neuronen. Zuvor wurde die Gesamtmotor Zusammensetzung des axonalen vesikulären Ladungen auf heterogene Populationen von biochemisch gereinigt Vesikeln und Organellen 9,15 getestet. Jedoch Charakterisierung Motorzusammensetzung für einen <e…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS 1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.
Materials
| Reagent and Equipment Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1X) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100X) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1X) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24X40mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | N/A | |
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | N/A | |
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymoraph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. |
Referenzen
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