Il muscolo scheletrico è essenziale per la locomozione ed è il principale negozio di proteine dei corpi. Muscle misure sanitarie all'interno C. elegans sono descritti. I potenziali modifiche alla struttura e la funzione muscolare, valutati in base GFP localizzate e coloranti cationici.
Il muscolo è un tessuto dinamico che risponde ai cambiamenti di alimentazione, esercizio fisico, e lo stato di malattia. La perdita di massa muscolare e della funzione con la malattia e l'età sono significativi oneri di sanità pubblica. Al momento capiamo poco sulla regolazione genetica della salute dei muscoli con la malattia o l'età. Il nematode C. elegans è un modello stabilito per la comprensione della regolazione genomica dei processi biologici di interesse. Muscoli della parete del corpo di questo worm mostrano un elevato grado di omologia con i muscoli delle maggiori specie metazoi. Poiché C. elegans è un organismo trasparente, la localizzazione di GFP ai mitocondri e sarcomeri permette la visualizzazione di queste strutture in vivo. Allo stesso modo, l'alimentazione degli animali coloranti cationici, che si accumulano basato sull'esistenza di un potenziale di membrana mitocondriale, permette la valutazione della funzione mitocondriale in vivo. Questi metodi, e anche la valutazione di proteine muscolari omeostasisis, sono combinati con la valutazione della intera funzione muscolare animale, sotto forma di saggi di movimento, per consentire la correlazione dei difetti sub-cellulari con misure funzionali del rendimento muscolare. Così, C. elegans offre una potente piattaforma con cui valutare l'impatto delle mutazioni, gene knockdown, e / o composti chimici sulla struttura e la funzione muscolare. Infine, come GFP, coloranti cationici, e saggi di circolazione sono valutati in modo non invasivo, studi prospettici della struttura e della funzione muscolare possono essere condotte attraverso l'intero corso della vita e questo al momento non possono essere facilmente studiati in vivo in qualsiasi altro organismo.
Il muscolo è un tessuto multifunzionale, molto apprezzato per il suo ruolo nella locomozione, supporto posturale e il metabolismo. Lo sviluppo e la manutenzione del muscolo sano richiede il coordinamento di più processi e dei componenti cellulari. Sia attraverso il danno o la malattia, disregolazione può verificarsi, con conseguente struttura muscolare alterata e / o la funzione. Declino associato all'età nella funzione muscolare rappresenta un onere significativo per la spesa sanitaria nel mondo occidentale, dal momento che la massa 1,2 e in particolare la forza muscolare e la resistenza muscolare 3-5 sono negativamente correlati con la mortalità. La misurazione di aspetti legati alla funzione muscolare deterioramento come ad esempio la funzione mitocondriale alterata o interruzione sarcomero, in grado di consentire una migliore comprensione dei meccanismi alla base dello sviluppo muscolare generale e la salute.
Elegans C aenorhabditis (C. elegans) è un nematode microscopico best noto perché è stato il primo organismo multicellulare ad avere il suo intero genoma sequenziato 6, il primo ad avere i geni silenziati con RNAi 7, e l'unico ad avere i suoi metazoi intera linea cellulare e neuroanatomia 8 9 determinata. C. elegans è stato proposto prima come un modello per lo studio del controllo genetico del comportamento nel 1974 da Sydney Brenner 10 e l'importanza di questo lavoro e la successiva è stato riconosciuto con il primo dei tre premi Nobel assegnati a C. elegans ricercatori. Circa il 35% di C. elegans geni ortologhi hanno identificato negli esseri umani, con C. elegans essere un organismo chiave utilizzata per comprendere il controllo genetico dello sviluppo muscolare 11. Quasi ogni gene nel genoma di C. elegans può essere abbattuto attraverso RNAi 7,12. Così, abbattendo geni nel muscolo pienamente sviluppata, componenti genetiche contribuire alla ripresagolamento di salute dei muscoli può essere indagato con relativa semplicità 13.
La capacità combinata di utilizzare RNAi, mutanti, e composti chimici rende C. elegans un sistema di primo ministro per esplorare la regolazione genetica 7,14,15 della struttura e della funzione muscolare con 16 anni e in modelli di malattia 17. L'impatto di knockdown gene, mutazioni e / o esposizione a composti chimici su struttura e / o funzione muscolare può essere misurata attraverso molteplici aspetti. Qui descriviamo brevemente semplici tecniche di valutazione C. elegans struttura muscolare e la funzione, molti dei quali può essere utilizzato in studi prospettici di salute dei muscoli.
Lo sviluppo della proteina fluorescente verde (GFP) 18 ha permesso la visualizzazione sia della frazione di specifiche proteine e la struttura generale degli organelli in C. elegans. Qui spieghiamo come GFP espressa specifically all'interno del corpo mitocondri muscolari parete, nuclei, o sarcomeri possono essere usati per determinare se la distrofia di queste strutture subcellulari è presente. Poiché la struttura non è sempre un surrogato affidabile per la funzione, abbiamo anche spiegato come l'uso di coloranti cationici in vivo permette la valutazione del potenziale di membrana mitocondriale alterata all'interno del muscolo. Quando i coloranti vengono utilizzati in combinazione con GFP, permettono lo studio di architettura e funzione in maniera temporale tutta la durata della vita. Infine, spieghiamo anche come omeostasi delle proteine all'interno del muscolo può essere valutata e in che modo tutte queste misure può essere utilizzato per correlare i cambiamenti in tutto la salute dei muscoli degli animali mediante l'utilizzo di test di movimento. Queste tecniche, combinate con knockdown genico, mutazioni, e / o composti chimici forniscono un potente arsenale per studiare come geni o composti specifici influenzano la salute dei muscoli in vivo. I paralleli nella struttura, metabolismo e funzioni grosso del muscolo tra C. elegans emammiferi significano C. elegans è un organismo modello eccezionale per comprendere la regolazione del muscolo in organismi superiori, inclusi gli esseri umani.
Questi metodi consentono l'esplorazione del muscolo dal macrophysiology di movimento per individuare difetti subcellulari che sono sufficienti a provocare un difetto di movimento. Quando combinato questi metodi permettono un'analisi dettagliata del muscolo. La conoscenza acquisita permette ulteriori test di ipotesi orientata muscolari che riguardano in generale la fisiologia, fisiopatologia e l'invecchiamento.
Movimento saggi
Un difetto movimento indica una perturbazione della normale funzione neuromuscolare. Questo può essere specifico per i nervi o muscoli o può essere comune tra i diversi tessuti. Le tappe più difficili di portare a termine i test di movimento stanno selezionando i vermi che sono rappresentative della popolazione e / o il trattamento, e assicurando inoltre che lo sperimentatore non ferire l'animale al momento del trasferimento a M9. E 'importante avere una grande dimensione del campione per ottenere una valutazione accurata rappresentativo e di movimento. Quando saggiare altamente pennaeffetti etrant, per esempio come spesso visto nei mutanti, un campione di dieci animali ciascuno valutato per il movimento dieci volte è sufficiente trovare differenze statisticamente significative rispetto wild-type. Tuttavia, la semplicità del test di movimento e facilità di coltura C. elegans significa che centinaia di vermi possono rapidamente essere valutati al fine di garantire risultati quantitativamente robusti. Quando saggiare effetti che appaiono presente solo in una porzione di una popolazione è importante determinare quale percentuale della popolazione sembra essere influenzata e la gravità dei difetti negli animali più colpite. In tali situazioni un maggior numero di animali dovrebbero essere valutati al fine di fornire i dati minimi per la percentuale di popolazione colpita. Spesso sia droga e trattamenti RNAi produrranno gravi difetti di movimento in una piccola percentuale della popolazione. In alcuni casi, l'aumento della dose di trattamento e o il metodo di consegna aumenterà la percentuale di affanimali ette e curve dose-risposta in esecuzione può essere utile per determinare la concentrazione ottimale di un farmaco o RNAi. Una seconda limitazione di questo saggio movimento è che i vermi sono manipolati per valutare il movimento. Così, i vermi sono entrambi stimolati e sottoposti ad un certo grado di stress osmotico alla raccolta in liquido. Il grado di stress osmotico può essere limitata utilizzando M9 o BU tampone 19 rispetto all'acqua. Alcune di queste limitazioni sono alleviati misurando il movimento abituale su piatti utilizzando sistemi di localizzazione disponibili in commercio 34 o plug-in gratuiti per ImageJ 35. Misurare la velocità di movimento di un animale può fornire informazioni importanti per quanto riguarda la salute dei muscoli in generale, compresi i cambiamenti di funzione che può essere misurato in tutta la durata della vita e la non invasività di questo metodo è fondamentale per gli studi per tutta la vita i potenziali di funzione muscolare.
Imaging del dell'apparato contrattile
<p class = "jove_content"> Il ceppo verme utilizzato qui per la struttura dell'apparato contrattile immagine era PJ727 36 che esprime una proteina di fusione GFP miosina che è localizzato a sarcomeri nei muscoli della parete del corpo. L'utilizzo di questo ceppo permette la visualizzazione della struttura del sarcomero in animali vivi. Simile al dosaggio movimento sopra descritto, un vantaggio fondamentale dell'utilizzo GFP etichettati sarcomeri valutare struttura sarcomero è che il metodo è relativamente non invasivo e quindi può essere utilizzata per seguire prospetticamente struttura sarcomero nei singoli animali tutta la durata della vita. La difficoltà maggiore di questo metodo è che i vermi che viene esposta sono ancora vivi e quindi in movimento, il che rende difficile ottenere immagini ben focalizzate-. Diversi metodi possono essere impiegati per ridurre il movimento e rendere più semplice l'imaging; questi includono l'anestesia o paralizzare i vermi e l'immobilizzazione tramite pressione di aspirazione, o l'uso di una soluzione ad alta viscosità. Ciascuno di questi metodi di immobilizzione presenta l'inconveniente che può alterare stessa funzione neuromuscolare. Pertanto, è essenziale includere adeguati controlli non trattati nell'analisi. Può anche essere opportuno utilizzare almeno due metodi indipendenti di immobilizzazione per confermare i risultati non sono causa di problemi con il metodo di immobilizzazione, a seconda di come ampiamente utilizzato il metodo di immobilizzazione scelto sia per la questione in esame. Qui abbiamo usato una semplice pressione del coprioggetto sulla vite senza fine di indurre il movimento ridotta. Dopo aver posizionato il vetrino, il liquido sotto il vetrino evapora e il vetrino viene quindi cominciare a produrre più pressione sulle viti senza fine, in genere questo richiede 2-5 minuti per produrre abbastanza movimento ridotta per consentire un facile imaging.È essenziale monitorare i vermi da vicino dopo il vetrino è stato introdotto come la pressione alla fine aumenterà sufficiente a causare i vermi a scoppiare da una pressione eccessiva, in genere 10-15 minuti dopo la coInoltre verslip. Buffer aggiuntivo può essere introdotto con l'ausilio di una pipetta attorno ai bordi del coprioggetto per evitare schiacciamento ai vermi. Lo smalto per unghie può essere usata per sigillare i bordi del vetrino e prevenire l'evaporazione, anche se questo impedisce il recupero di animali da sotto il vetrino, se desiderato. Analogamente, l'uso di perle di silicone nella soluzione può aiutare a ridurre la quantità di pressione luoghi coprioggetto sui vermi.
Proprio come valutare una deficienza movimento, è importante considerare la penetranza di effetto. Penetranza può essere considerato elevato se 80-100% animali mostrano un fenotipo sulla piastra NGM, parziale se 21-79% e basso se ≤20% del display popolazione di un effetto. Per gli effetti altamente penetranti, campioni di dimensioni più piccole possono essere utilizzati per produrre significativi dati quantitativi sui difetti sarcomero. Nei casi in cui l'effetto ha una penetranza bassa, la selezione degli animali da visualizzare per un difetto evidente movimento in risposta a farmacio il trattamento RNAi può essere utile nel saggiare difetti sarcomero in animali più colpite dal trattamento. Tuttavia, non è necessariamente il caso che l'entità dell'effetto del trattamento sul movimento e struttura subcellulare è la stessa. Pertanto, può essere desiderabile per esaminare il grado di difetti presenti in una grande popolazione, per esempio 100 animali. Ciò consente comprensione della distribuzione dei difetti tutta una popolazione. Può anche essere opportuno esaminare la misura del difetto negli animali più colpite e / o esaminare la correlazione tra entità del difetto sarcomero ed estensione del movimento difetto. Potenziali difficoltà a parte, questo metodo è più veloce e più facile che altre modalità di valutazione struttura sarcomero. Questa velocità e la facilità è, tuttavia, soggetta a una limitazione chiave, sarcomeri contenenti proteine di fusione GFP non sono del tutto normali 37 e, pertanto, la valutazione di sarcomeri perturbato deve essere confermato utilizzando altri metodi più alta intensità di lavoro.Questi metodi includono l'uso di luce polarizzata 38, falloidina colorazione 39, e immunofluorescenza indiretta 40. Di questi metodi, solo la luce polarizzata è relativamente non invasiva; gli altri metodi richiedono fissaggio e quindi non possono essere utilizzate in studi prospettici di singoli animali, piuttosto possono essere utilizzati solo per confermare, attraversare sectionally, i risultati di tali studi.
Imaging di mitocondriali Networks
Il ceppo verme utilizzato per gli esperimenti di imaging mitocondriali era CB5600 7 che esprime una proteina di fusione GFP localizzata ai mitocondri e GFP β-galattosidasi proteina di fusione localizzata ai nuclei, sia nei muscoli della parete del corpo. Come con l'uso di PJ727 per sarcomeri di imaging, l'uso di questo ceppo permette la visualizzazione della struttura della rete mitocondriale negli animali viventi. Così, questo ceppo può essere utilizzato per valutare cambiamenti dinamici che si verificano, ad esempio ridotta mitochofusion ndrial e / o aumento della fissione mitocondriale 41. Anche per quanto riguarda sarcomeri di imaging, la più grande difficoltà di questo metodo è che i vermi viene esposta sono ancora vivi e in movimento, il che rende difficile ottenere immagini ben focalizzati. Mentre diversi metodi, come discusso in maggior dettaglio in precedenza, possono essere impiegati per ridurre il movimento, mitocondri sembrano particolarmente sensibili a interventi che inducono il movimento ridotta. Per esempio, più comunemente usato componenti anestetici bersaglio della catena respiratoria mitocondriale e pertanto deve essere utilizzato con cautela in studi sulla struttura mitocondriale normale e funzione. Allo stesso modo, la maggior parte degli agenti paralitico devono essere usati con cautela in studi sulla struttura e la funzione mitocondriale normale, come la maggior parte degli agenti di paralisi causano meno segnale di passare attraverso la giunzione neuromuscolare e denervazione funzionale del muscolo è sufficiente ad indurre la frammentazione mitocondriale. Gli esperimenti in questo studio impiegati pressione per immobilizzare animalis ma altri hanno utilizzato con successo levamisolo 42, anche se è essenziale animali immagine immediatamente.
Infine, vari contaminanti batterici nelle culture, per esempio B. subtilis, possono indurre la frammentazione mitocondriale; quindi è essenziale includere adeguati controlli non trattati nell'analisi. Per gli effetti altamente penetranti, campioni di dimensioni più piccole possono essere utilizzati per produrre significativi dati quantitativi sui difetti di rete mitocondriali. Tuttavia, a causa della prevalenza di difetti minori nella rete mitocondriale, questo piccolo numero di animali è probabile che sia il doppio del numero necessario per la valutazione della struttura sarcomero. Nei casi in cui l'effetto ha una bassa penetranza, selezione di animali che mostra chiaramente un difetto di movimento in risposta al farmaco o trattamento RNAi può essere utile nel saggiare difetti mitocondriali in animali più colpite dal trattamento. Tuttavia, come già detto, non è necessariamente il caso che ilentità dell'effetto del trattamento sul movimento e struttura subcellulare è la stessa. Pertanto, può essere desiderabile per esaminare il grado di difetti presenti in una grande popolazione, ad esempio 150-200 animali, nonché il grado di perturbazione negli animali più gravemente colpite e la presenza o assenza di portata di interruzione con portata di movimento difetto. Altri ceppi con contrassegnati in modo fluorescente mitocondri possono essere utilizzati per confermare i risultati ottenuti in CB5600, tuttavia, l'uso di proteine fluorescenti differenti possono influenzare la rete basale dei mitocondri. Ad esempio, l'uso di una RFP proteine TOMM-20 fusione di visualizzare mitocondri sembra causare un aumento basale frammentazione mitocondriale rispetto all'uso di GFP mitocondrialmente localizzato 17. Mentre altri metodi come immunofluorescenza e microscopia elettronica possono essere utilizzati per valutare la struttura mitocondriale, non permettono la valutazione in vivo delle dinamiche mitocondriali perché un passo fissazione è richieded. Altri metodi come l'uso di coloranti mitocondrialmente localizzate possono essere usate senza fissazione e quindi possono essere utilizzati anche in luogo di utilizzo della GFP mitocondrialmente localizzata. Come discusso nella sezione successiva, l'utilizzo di questi coloranti permette anche la valutazione in vivo grezza di funzione mitocondriale.
Valutare il potenziale di membrana mitocondriale in vivo in C. elegans
Una varietà di coloranti sono disponibili per l'etichettatura mitocondri 28. Questi coloranti forniscono un metodo alternativo di visualizzare la struttura di rete mitocondriale in C. elegans vivo. Molti di questi coloranti inoltre permettono la valutazione grezza di funzionalità mitocondriale in vivo perché si accumulano nei mitocondri basate sul potenziale di membrana mitocondriale. Qui abbiamo usato C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, che viene ingerito attraversoil tratto digerente, con qualche aggiunta entrare il verme tramite la cuticola causa della permeabilizzazione offerta dalla sua dissoluzione in 0,5% DMSO. A seguito dell'entrata in cella C 32 H 32 Cl 2 N 2 O viene ossidato e sequestrata dai mitocondri dove si lega aminoacidi contenenti zolfo (ad esempio, metionina e cisteina). La formazione di questi complessi peptide-colorante significa C 32 H 32 Cl 2 N 2 O rimane nei mitocondri volta etichettati 28. Una difficoltà chiave con l'uso di coloranti mitocondriali è che essi etichettare tutti mitocondri nell'animale. Per questo abbiamo svolto l'etichettatura in CB5600, lo stesso ceppo sopra descritto per la valutazione del muscolo struttura di rete mitocondriale. Utilizzando un colorante rosso mitocondriale, un ceppo di vermi esprimenti GFP nei mitocondri muscolari, ed un filtro passa tripla, è relativamente semplice immagine solo mitocondri nel muscolo trovando mitocondri che sono ogamma di colocalizzazione di colorante rosso e mitocondri GFP etichettati. Il passo più difficile nello svolgimento di questo approccio co-localizzazione è l'imaging in quanto il colorante è foto-sbiancato in pochi secondi sotto luce fluorescente ad alta intensità. Questo effetto può essere limitato mantenendo la fluorescenza a bassa potenza fino sperimentatore è pronta ad immagine e quindi regolando l'intensità di fluorescenza di conseguenza. Una volta che si è sperimentato con l'uso di coloranti altro approccio è quello di utilizzare la microscopia confocale con Z-stack a immagine solo mitocondri nel tessuto giusto; le reti mitocondriali nel muscolo sono ben distinti rispetto ad altri tessuti. Purtroppo, l'incapacità di C 32 H 32 Cl 2 N 2 O lasciare mitocondri 28 significa che, a differenza delle tecniche sarcomero e di imaging mitocondriale discusso sopra, non può essere utilizzata per seguire prospetticamente perdita di funzione mitocondriale con il tempo, a meno C 32 H 32 Cl 2 N 2 Oè aggiunto in momenti discreti per separare popolazioni animali. Questa limitazione può essere superata utilizzando coloranti come JC-10 che fanno lasciare i mitocondri su crollo del potenziale di membrana 43. I mitocondri può anche essere isolato da C. elegans 30 per le successive analisi biochimiche. Tale estrazione permette la quantificazione del potenziale di membrana mitocondriale quantificando il tasso di assorbimento lipofilo colorante cationico usando la citometria a flusso o un lettore di piastre a fluorescenza 44. Dopo aver stabilito una alterata potenziale di membrana mitocondriale, è anche possibile determinare se la perdita di gradiente protonico traduce in una perdita di produzione di ATP utilizzando un metodo basato luciferasi-bioluminometric sensibili 45.
Valutare Proteina degradazione in C. elegans
Il ceppo verme qui utilizzato per valutare la degradazione delle proteine muscolari era PD55, che contiene un β specifico muscologalattosidasi che viene continuamente sintetizzato durante tutto lo sviluppo fino a raggiungere l'età adulta e che rimane stabile nel citosol per il prossimo 72-96 ore 19. Pertanto, la misurazione dei livelli di β-galattosidasi durante lo sviluppo indica principalmente l'impatto degli interventi sulla sintesi dal promotore miosina, mentre la perdita di β-galattosidasi durante l'età adulta indica un intervento ha provocato un aumento della proteina citosolica degrado 19. Il passaggio chiave nella valutazione dell'attività β-galattosidasi è garantire essiccazione efficace. La mancata essiccare efficacemente gli animali si traduce in scarsa prestazione del substrato X-gal e quindi scadente di colore blu nei muscoli del corpo parete degli animali. Per assicurare una buona essiccazione il sigillo sulla essiccatore deve essere controllata e il campione deve essere controllato ad intervalli di 5-10 minuti in tutta essiccazione per valutare i progressi (ad esempio, il campione di 20 ml dovrebbe essere asciugato in 10 minuti e il restante 20 minè quello di garantire essiccazione completa). Il saggio β-galattosidasi è un saggio di attività quindi un controllo appropriato è essenziale. Inoltre, una diminuzione colorazione degli adulti in una condizione di trattamento rispetto al controllo non dimostra che sta avvenendo il degrado; piuttosto indica una diminuzione dell'attività enzimatica in risposta al trattamento. Per confermare il degrado, più analisi western blot alta intensità di lavoro deve essere completato contro β-galattosidasi 13 e questo permette la degradazione delle proteine quantificazione in piccole popolazioni di vermi contati. Occidentali densità di banda Blot possono essere quantificati con ImageJ 46. Un altro limite di questo metodo è che l'uso di proteine transgeniche non informare in relazione agli obiettivi fisiologici di degrado e per tali risposte ipotesi guidato Western blot proteomica e / o mirati devono essere impiegati 13. Infine, come la sintesi della proteina transgenica impiegato in questi studi si spegne nella prima età adulta 19 </sup>, altri metodi devono essere utilizzati quando si vuole esaminare le alterazioni nella sintesi delle proteine muscolari in pieno sviluppo C. elegans muscolare; per esempio, i metodi isotopici stabili o radioattivi.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) | Invitrogen | M-7512 | Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential |
DMSO | Thermo Scientific | 67-63-5 | |
KH2 PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
Na2HPO4 | BDH | 301584L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
MgSO4 | Sigma | M-7506 | |
Microscopy Slides | Starfrost | K220 | |
Microscopy Cover Slips | VW2 International | 631-0124 | |
1.5ml Eppendorph Tubes | Fisher Scientific | FB74031 | |
Dessicator | Nalgene | D2672 | |
Nikon Microscope | Nikon | H600L | Nikon H600L microscope with proprietary software |
Nikon Camera | Nikon | DS-Fi1 | Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera |
Zeiss Microscope | Zeiss | Ax10 | Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter |
Plates 9cm | Starstedt | 82-1473 | |
Plates 6cm | Gosselin | BP53-01 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
Na3PO4 | Sigma-Aldrich | 7601-54-9 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside | Sigma-Aldrich | 7240-90-6 | |
N,N8-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 68-12-2 | |