In-vivo-und In-vitro-Aufzucht von Nematoden (Steinernematidae und Heterorhabditidae)
Summary
Das Ziel dieser Präsentation ist es, in vivo und in-vitro-Techniken für die Aufzucht von insektenpathogenen Nematoden zu demonstrieren. In-vivo-Verfahren betrachten die Aufzucht dieser Nematoden mit einer Insektenwirts, während die in-vitro-Methoden zu nutzen reichen Agar-Medien.
Abstract
Nematoden (EPN) (Steinernematidae und Heterorhabditidae) haben eine Partnerschaft mit mutualistic Gram-negative Gamma-Proteobakterien in der Familie der Enterobacteriaceae. Xenorhabdus Bakterien mit steinernematids Nematoden assoziiert, während Photorhabdus sind Symbionten heterorhabditids. Zusammen Nematoden und Bakterien bilden eine hohe insektizide Komplex, der eine breite Palette von Insektenarten in einer intimen und besonderen Partnerschaft tötet. Hier zeigen wir, in vivo und in vitro Techniken, die üblicherweise bei der Aufzucht dieser Nematoden unter Laborbedingungen eingesetzt. Darüber hinaus sind diese Techniken stellen wichtige Schritte für die erfolgreiche Etablierung von EPN Kulturen und bilden auch die Grundlage für andere Studien, die sich diese Organismen für die Forschung zu nutzen. Die Produktion von aposymbiotic (Symbiont-frei) Nematoden ist oft entscheidend für eine gründliche und vielseitige Herangehensweise an das Studium der Symbiose. DiesProtokoll erfordert nicht die Zugabe von Antibiotika und können in kürzester Zeit mit Standard-Laborausrüstung durchgeführt werden. Nematoden, die in dieser Weise hergestellt werden, sind relativ stabil, obwohl ihr Überleben in Speicher kann je nach den verwendeten Arten variieren. Die in dieser Präsentation detailliert Techniken entsprechen denen von verschiedenen Autoren beschrieben und P. Auf der Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, USA) verfeinert. Diese Verfahren unterscheiden sich von dem Körper der Techniken, die in der Massenproduktion dieser Organismen für Schädlingsbekämpfungszwecke verwendet werden.
Introduction
Nematoden (EPN) Steinernema und Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) und ihre bakteriellen Symbionten, Xenorhabdus und Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) gelten als eine emergente Modell von Landtier-Mikroben symbiotischen Beziehungen 2-4,6,10,19. Xenorhabdus und Photorhabdus spp. sind als Symbionten im Darm des einzigen frei lebenden Bühne der Nematoden, die auch als infektiöse juvenile (IJ) oder 3. Stufe infektiös Jugend 8,10,13 bekannt hegte. Das Bakterium-Nematoden Paar pathogen ist für eine breite Palette von Insekten und erfolgreich in der biologischen Bekämpfung und des integrierten Pflanzen-Management-Programme weltweit 6,8 umgesetzt worden.
Wir zeigen hier eine Auswahl von in vivo und in-vitro-Techniken, die häufig für die Aufzucht von EPN unter Laborbedingungen ausgeübt werden. Ichn-vivo-Verfahren betrachten eine Insektenwirts für die Aufzucht der Nematoden. In der Regel werden unreife Stadien der verschiedenen Insektenordnungen (dh Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, etc.) Als geeignete Wirte. In-vivo-Verfahren sind in der Regel für die Wartung der Nematodenkulturen im Labor betrachtet. Dieses Verfahren kann nicht geeignet sein, wenn man die Massenproduktion der Nematoden. Zu diesem Zweck fordern mehr Zeit und zusätzliche Kosten für die Insektenzucht beziehen, können große Mengen von Insekten Hosts erforderlich.
Nematoden können auch in vitro an verschiedenen Medien kultiviert werden. Je nach dem Ziel der Studie, in vitro Verfahren können oder betrachten die Einarbeitung der symbiotischen Bakterien in den Medien. In diesem Vortrag beschreiben wir zwei häufig verwendete Methoden für die Verbreitung des EPN. Die Bestandteile der Medien eine Quelle von Nährstoffen für die symbiotischen Bakterium einnd ein Sterin Quelle für die Nematoden. In-vitro-Methoden bieten den Vorteil, die Aufzucht von EPN ohne Insektenwirts.
Ursprünglich viele der entwickelten in vitro-Medien wurden für die Multiplikation verwendet werden, wenn geeignete EPN Insektenwirte sind nicht verfügbar. Doch in den vergangenen Jahren, in vitro Aufzuchtmethoden sind allgemein in der Forschung mit dem Ziel, die Beziehung zwischen mutualistic EPN und ihre symbiontischen Bakterien 17,19 verstehen beschäftigt.
Die in dieser Präsentation detailliert Techniken entsprechen denen von verschiedenen Autoren beschriebenen und von den Lizenz Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, USA) verfeinert. Diese Verfahren unterscheiden sich von dem Körper der Techniken, die in der Massenproduktion dieser Organismen für Schädlingsbekämpfungszwecke verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit einem geeigneten Wirt ist ein Schlüsselfaktor für die erfolgreiche Aufzucht von in vivo EPN. In der Regel können beide steinernematids und heterorhabditids vervielfältigen und zu ihren Lebenszyklus in Larven der Großen Wachsmotte, Galleria mellon (Lepidoptera: Pyralidae) erfolgreich abgeschlossen. Jedoch können auch andere Insektenarten aus verschiedenen Familien und / oder Bestellungen berücksichtigt werden. Einige der derzeit beschriebenen Nematodenarten sind bekannt, um die Spezifität f?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Vergangenheit Mitglieder der Lizenz Labor danken: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson und Sam-Kyu Kim für ihre Beiträge zur Verbesserung der viele dieser Protokolle. Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Science Foundation Grant IOS-0840932 und 0724978 IOS-SP Auf finanziert
Materials
| Material | Company | Catalog Number | Comments |
| For in vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter Paper, 9 cm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-Kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef Liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef Kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium Chloride 2.5g ( 0.5% final concentration ) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H20 | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient Broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast Extract, 5g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate, 10 ml (0.2g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn Oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn Syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H20 and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H20,890 ml |
Referenzen
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