RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi
Summary
RNA-sıralama ve biyoinformatik analizler fare EMLcells Lin-CD34 + ve Lin-CD34 alt gruplarda anlamlı ve farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu transkripsiyon faktörleri kendini sürekli yenileyen Lin-CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-CD34 hücreleri arasındaki geçiş belirlenmesinde önemli rol oynayabileceğine.
Abstract
Hematopoetik kök hücreler (HSC), lösemi ve lenfoma gibi birçok hastalıkta hastanın hematopoetik sistemi yeniden inşa etmek nakli tedavisi için klinik olarak kullanılmaktadır. HSC kendini yenileme ve farklılaşmasını kontrol eden mekanizmaların tanıtılması araştırma ve klinik kullanım için HKH'lerin uygulaması için önemlidir. Bununla birlikte, bunun nedeni, in vitro proliferasyonu edemedikleri için HKH'lerin büyük miktarda elde etmek mümkün değildir. Bu engeli aşmak için, bu çalışma için, bir model sistem olarak, bir fare kemik iliği türevi hücre hattı, EML (eritroid, miyeloid ve lenfositik) hücre hattı kullanılmıştır.
RNA sıralaması (RNA-Dizi) giderek artan bir gen ifade çalışmaları için mikrodizisi değiştirmek için kullanılmıştır. Biz burada EML hücre kendini yenileme ve farklılaşma düzenlenmesinde potansiyel anahtar faktörleri araştırmak için RNA-Sıra teknolojisini kullanarak ayrıntılı bir yöntem rapor. Bu yazıda verilen protokol üç bölüme ayrılmıştır. Ilk part nasıl kültür EML hücreleri ve ayrı Lin-CD34 + ve Lin-CD34 hücreleri açıklar. Protokolün ikinci bölümü, toplam RNA hazırlama ve yüksek sekanslama için daha sonra kütüphane yapımı için ayrıntılı prosedürler bulunmaktadır. Son bölüm RNA-Dizi veri analizi için yöntem açıklanır ve Lin-CD34 + ve Lin-CD34 hücreleri arasındaki farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri belirlemek için verilerin nasıl kullanılacağını açıklar. En önemli ölçüde farklı olarak ifade transkripsiyon faktörleri EML hücre kendini yenileme ve farklılaşmasını kontrol eden potansiyel kilit düzenleyiciler olduğu tespit edildi. Bu yazının tartışma bölümünde, bu deney başarılı performans için önemli adımlar vurgulayın.
Özetle, bu kağıt EML hücrelerinde kendini yenileme ve farklılaşma potansiyeli regülatörleri belirlemek için RNA-Sıra teknolojisini kullanarak bir yöntem sunar. Belirlenen anahtar faktörler in vitro ve i aşağı fonksiyonel analize tabi tutulurlarin vivo koşullarda.
Introduction
Hematopoetik kök hücreler erişkin kemik iliği niş ağırlıklı olarak ikamet nadir kan hücreleridir. Bunlar, kan yeniden doldurmak için gereken hücreleri ve immün sistem 1 üretimi için sorumludur. Kök hücrelerin bir tür olarak, HSC kendini yenileme ve farklılaşma kabiliyetine sahip bulunmaktadır. HKH'lerin kaderi kararını kontrol mekanizmaların tanıtılması, kendini yenileme veya farklılaşma ya doğru, kan hastalığı araştırmalar ve klinik kullanım için 2 HKH'lerin manipülasyon değerli rehberlik sunacak. Araştırmacılar tarafından karşılaşılan bir sorun, HSC muhafaza ve çok sınırlı bir ölçüde, in vitro olarak genişletilebilir olabilir; soylarına büyük çoğunluğu kısmen kültür 2 ayrıştırılmıştır.
Genom ölçeğinde kendini yenileme ve farklılaşma süreçlerini kontrol tuşuna regülatörleri tanımlamak için, biz bir model sistem olarak bir fare ilkel hematopoetik öncül hücre hattını EML kullanılır. Thhücre hattı fare kemik iliği 3,4 türetilmiştir edilir. Farklı büyüme faktörleri ile verildiğinde, EML hücrelerin in vitro 5 eritrosit, miyeloid ve lenfoid hücrelerine dönüştürmek olabilir. Önemli olarak, bu hücre hattı kültürü ortamı bunların multipotentiality tutma hala kök hücre faktörü (SCF) ihtiva eden ve büyük miktarda çoğaltılabilir. EML hücreler kendini sürekli yenileyen Lin-SCA + CD34 + alt popülasyonlar ayrılır ve kısmen yüzey belirteçleri CD34 ve SCA 6 dayalı Lin-SCA-CD34 hücreleri ayırt edilebilir. Kısa vadeli HKH'lerin, SCA + CD34 + hücrelerde de benzer kendini yenileme edebiliyoruz. Hızla Lin-SCA + CD34 + ve Lin-SCA-CD34 hücre karışık bir nüfus yeniden ve 6 çoğalmaya devam edebilirsiniz SCF, Lin-SCA + CD34 + hücre ile tedavi edildiğinde. Popülasyonlar morfolojik olarak benzer ve c-kit mRNA ve protein 6 benzer seviyelerine sahiptir. Lin-SCA-CD34 hücreleri, IL-3 yerine SCF3 ihtiva eden ortam içinde yayılan yeteneğine sahiptirler. Unveiling hematopoiez sırasında erken gelişimsel geçiş hücresel ve moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sunacak EML hücre kaderinin kararda kilit düzenleyiciler.
Kendini sürekli yenileyen Lin-SCA + CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-SCA-CD34 hücreleri arasındaki yatan moleküler farklılıkları araştırmak amacıyla, farklı şekilde ifade genleri tanımlamak için RNA-seg kullanılır. Transkripsiyon faktörleri hücre kaderini belirlemede önemli olduğu gibi, özellikle biz, transkripsiyon faktörleri odaklanmak. RNA-Seq profil ve genom 7,8 transkripsiyonu RNA'lar ölçmek için (NGS) teknolojileri yeni nesil dizileme yeteneklerini kullanan yeni geliştirilmiş bir yaklaşımdır. Kısaca, total RNA, poli-A, ilk template.The RNA şablonu ile sonra ters transkriptazı kullanılarak cDNA'ya dönüştürülür olarak seçilir ve parçalanmış. CDNA kütüphanesinin oluşturulması için sağlam olmayan bozulmuş RNA kullanılarak, tam uzunlukta RNA transkriptlerinin haritasını yapmak için önemlidir. Amaçlarlasekanslama poz, belirli bir adaptör dizileri cDNA'nm her iki ucuna eklenir. Daha sonra, bir çok durumda, cDNA molekülleri, PCR ile amplifiye edilmiş ve yüksek verimli bir şekilde dizildi.
Sekanslama sonra, elde edilen bir bir referans genom ve transkriptom veritabanına hizalanabilir okunur. Sayısı referans gen haritası sayılır ve bu bilgi gen salgılama seviyesini tahmin için kullanılabileceğini okur. Ayrıca sigara model organizmaların 9 transcriptomes incelenmesini sağlayan bir referans genom olmadan de novo monte edilebilir okur. RNA-DİZ teknolojisi aynı zamanda ek yeri izoformları 10-12, yeni transkriptler, 13 ve gen füzyonlarının 14 tespit etmek için kullanılmıştır. Protein kodlayan genlerin saptanması ek olarak, RNA Dizi aynı zamanda gibi kodlayıcı olmayan RNA'lar, transkripsiyonu seviyesini roman tespit ve analiz etmek için kullanılabilir uzun siRNA'nın vb 18 RNA 15,16, mikroRNA 17, kodlayıcı olmayan. Çünkü tBu yöntemin de hassasiyeti, tekli nükleotit varyasyonları 19,20 tespiti için kullanılmıştır.
RNA-Seq teknolojisinin gelişiyle önce, mikrodizin gen ifadesi profili analiz etmek için kullanılan ana yöntem oldu. Önceden tasarlanmış probları sentezlenebilir ve daha sonra, mikro-dizi slayt 21 oluşturmak üzere bir katı yüzeye bağlanır. mRNA, ekstre edilmiş ve cDNA'ya dönüştürülür. Ters transkripsiyon işlemi sırasında, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin cDNA dahil edilir ve cDNA mikrodizi slaytlar üzerine hibridize edilebilir. Belirli bir noktaya toplanan sinyalin yoğunluğu, bu noktada 21 spesifik prob bağlanma cDNA'nın miktarına bağlıdır. RNA-Seq teknolojisi ile karşılaştırıldığında, mikrodizin çeşitli sınırlamalar vardır. RNA-Seq teknoloji kullanımını zaman sınırlar görece yüksek arka plan düzeyinde roman transkript tespit edebiliyor iken Birincisi, mikrodizin, gen şerhin önceden varolan bilgiye dayanır gene ifade seviyesi düşüktür. Bağlı arka plan ve sinyallerin doymaya mikrodizisinin hassasiyeti de, yüksek ve aşağı ifade edilen genlerin 7,22 ile sınırlıdır, oysa Bunun yanı sıra, RNA-Dizi teknoloji, algılama (8.000 kat) 7 çok daha yüksek bir dinamik aralığı vardır. Son olarak, mikrodizi probları bir örnek 23 içindeki farklı transkriptlerinin nispi temsil seviyelerini karşılaştırırken sonuçları daha az güvenilir hale hibritleştirme verimlilikleri, farklıdır. RNA-Seq mikrodizisinden üzerinden pek çok avantajı olmasına rağmen, veri analizi karmaşık. Bu, birçok araştırmacılar hala RNA-Sek yerine mikrodizisini kullanmak nedenlerinden biridir. Çeşitli biyoinformatik araçları RNA-Dizi veri işleme ve analiz 24 için gereklidir.
Birkaç nesil dizileme (NGS) platformlar arasında, 454, Illumina, KATI ve İyon Torrent en yaygın kullanılan olanlardır. 454 ilk ticari NGS platform oldu. Diğer sıralama platformlar aksineBu tür Illumina ve bir katı halinde, 454 platformu okunmayacak oluşturur uzunluğu 25 (ortalama 700 baz kaydeder). Nedeniyle daha uzun daha yüksek verim 25 monte onların için transcriptiome ilk karakterizasyonu için daha iyi okur. 454 platformunun ana dezavantajı dizisinin megabase başına yüksek maliyet. Oluşturmak Illumina ve KATI platformları sayısının artması ve kısa uzunluklarda okur. Dizisinin megabase başına maliyet 454 platformu çok daha düşüktür. Nedeniyle Illumina ve SOLID platformları için okur kısa, çok sayıda, veri analizi çok fazla hesaplama yoğundur. İyon sel platformu için sıralama için alet ve reaktiflerin fiyatı ucuzdur ve sıralama süresi 25 daha kısadır. Ancak, hata oranı ve dizinin megabase başına maliyeti yüksek Illumina ve SOLID platformlara karşılaştırılır. Farklı platformlar kendi avantajları ve dezavantajları vardır ve veri analizi için farklı yöntemler gerektirir. Platform sıralama amacı ve finansman durumuna göre seçilmelidir.
Bu yazıda, bir örnek olarak Illumina RNA-Dizi platform almak. Biz EML hücre kendini yenileme ve farklılaşma anahtar düzenleyicileri araştırmak için bir model sistem olarak EML hücresi kullanılan ve ifade seviyesi hesaplama ve roman transkript tespiti için RNA-Dizi kütüphane yapımı ve veri analizi yöntemleri ayrıntılı sağladı. Biz EML model sisteminde 2 RNA-seq çalışma, zaman fonksiyonel testi (örn ShRNA demonte) hematopoetik farklılaşma erken aşamalarında moleküler mekanizmasının anlaşılması açısından güçlü bir yaklaşım sağlamak ile birleştiğinde bizim önceki yayın göstermiştir, ve bir olarak hizmet verebilir genel olarak hücre kendini yenileme ve farklılaşma analizi için bir model.
Protocol
Representative Results
Discussion
Memeli transcriptome 34-38 çok karmaşık. RNA-Seq teknoloji It gen ifadesi analizi için diğer yöntemlere göre birçok avantajı vardır transcriptome analizi, roman transkript tespiti ve tek nükleotid varyasyon keşif vb çalışmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Girişte de belirtildiği gibi, mikrodizi hibridizasyon eserler üstesinden gelir ve yeni bir transkript de novo tanımlamak için kullanılabilir. RNA-sıralamasının bir sınırlama Sanger dizileme karşıla?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund—Memorial Hermann Foundation.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | BHK cell culture |
| Anti-Mouse CD34 FITC | eBioscience | 11-0341-81 | FACS sorting |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | eBioscience | 12-5981-81 | FACS sorting |
| APC Mouse Lineage Antibody Cocktail | BD Biosciences | 558074 | FACS sorting |
| BD FACSAria Cell Sorter | BD Biosciences | Special offer sysmtem | FACS sorting |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 75cm2 | Corning incorporated | 430641 | Cell culture |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 25cm2 | Corning incorporated | 430639 | Cell culture |
| Deoxyribonuclease I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068-015 | Library preparation |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | BHK cell culture |
| DPBS | Gibco | 14190 | Cell culture |
| HI FBS | Invitrogen | 16140071 | BHK cell culture |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050-122 | EML cell culture |
| IMDM | HyClone | SH30228.02 | EML cell culture |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Cell culture |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Isolation of lineage negative cells |
| NanoVue Plus spectrophotometer | GE Healthcare | 28-9569-62 | Quality control |
| Thermo Scientific™ Napco™ 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Scientific | 15-497-002 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | EML cell culture |
| TRIzol® Reagent | Invitrogen | 15596-018 | RNA exraction |
| TruSeq™ RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn) | Illumina | RS-122-2002 | Library preparation |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939AA | Quality control |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | Cell culture |
| 0.45 µm Syringe Filters | Nalgene | 190-2545 | Cell culture |
Referenzen
- Chambers, S. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential. Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS genetics. 8, (2012).
- Ye, Z. J., et al. Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).
- Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development. Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).
- Weiler, S. R., et al. D3: a gene induced during myeloid cell differentiation of Linlo c-Kit+ Sca-1(+) progenitor cells. Blood. 93, 527-536 (1999).
- Ye, Z. J., Kluger, Y., Lian, Z., Weissman, S. M. Two types of precursor cells in a multipotential hematopoietic cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18461-18466 (2005).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Chu, Y., Corey, D. R. RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation. Nucleic acid therapeutics. 22, 271-274 (2012).
- Hornett, E. A., Wheat, C. W. Quantitative RNA-Seq analysis in non-model species: assessing transcriptome assemblies as a scaffold and the utility of evolutionary divergent genomic reference species. BMC genomics. 13, 361 (2012).
- Eswaran, J., et al. RNA sequencing of cancer reveals novel splicing alterations. Scientific reports. 3, 1689 (2013).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Wu, J. Q., et al. Dynamic transcriptomes during neural differentiation of human embryonic stem cells revealed by short, long, and paired-end sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5254-5259 (2010).
- Loraine, A. E., McCormick, S., Estrada, A., Patel, K., Qin, P. RNA-seq of Arabidopsis pollen uncovers novel transcription and alternative splicing. Plant physiology. 162, 1092-1109 (2013).
- Edgren, H., et al. Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing. Genome biology. 12, 6 (2011).
- Ilott, N. E., Ponting, C. P. Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing. Methods. 63, 50-59 (2013).
- Sun, L., et al. Prediction of novel long non-coding RNAs based on RNA-Seq data of mouse Klf1 knockout study. BMC bioinformatics. 13, 331 (2012).
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods in molecular biology. 822, 183-188 (2012).
- Bolduc, F., Hoareau, C., St-Pierre, P., Perreault, J. P. In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection. BMC molecular biology. 11, 16 (2010).
- Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq. Nucleic acids research. 37, 106 (2009).
- Djari, A., et al. Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing. BMC genomics. 14, 307 (2013).
- Murphy, D. Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects. Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).
- Chen, K., et al. RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level. PLoS one. 8, 72567 (2013).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome research. 18, 1509-1517 (2008).
- Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. How to analyze gene expression using RNA-sequencing data. Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).
- Glenn, T. C. Field guide to next-generation DNA sequencers. Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature protocols. 7, 562-578 (2012).
- Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 10, 25 (2009).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature. 28, 511-515 (2010).
- Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome biology. 11, 106 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Cheranova, D., et al. RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells. J Vis Exp. , (2013).
- Zhang, H. M., et al. AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database. Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).
- Wu, J. Q., et al. Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome. Genome Biol. 9, 3 (2008).
- Wu, J. Q., et al. Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones. Biotechniques. 36, 690-696 (2004).
- Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing. Genome Res. 14, 665-671 (2004).
- Dewey, C., et al. Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat. Genome Res. 14, 661-664 (2004).
- Wu, J. . Characterize Mammalian Transcriptome Complexity. , (2011).
