담배 연기에 노출 된 마우스의 폐 폐기종 및 작은기도 리모델링 자동 측정
Summary
The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.
Abstract
COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill’s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson’s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.
Introduction
어떤 모델이 완벽하게 인간의 질병 (2)의 모든 기능을 복제 할 수 없기 때문 만성 폐쇄성 폐 질환을 연구하는 동물 모델의 사용은 도전이다. 대부분의 연구자들은 때문에 폐 생리학, 병리학, 유전학, 대사 산물의 생쥐와 인간 사이의 유사성 만성 폐쇄성 폐 질환을 모델링하기 위해 마우스를 사용합니다. 또한, 마우스는 공부를 상대적으로 저렴하고, 폐기종 및 작은기도 개형 모두 CS 노출 (5,7-9) 6 개월 이내에 개발할 수 있습니다.
담배 연기에 의한 COPD : 여러 가지 방법이 쥐에서 만성 폐쇄성 폐 질환을 유발 할 수 있습니다. 대부분의 연구자들은 인간의 만성 폐쇄성 폐 질환의 주요 병인 인자 CS에 쥐를 노출. 6 개월 CS 노출 폐기종 마우스에서 작은기도 개형 (SAR)의 발전을 초래하지만, 유도되는 질환의 중증도 공부 뮤린 균주에 따라 다양하다. AKR / J 생쥐 extremel 반면 예를 들어, 마우스는 NZWLacZ CS – 유도 기종의 개발에 강한민감한 Y (10). 대부분의 연구자들은 많은 유전자 타겟 마우스이 변형에서 사용할 수있는 CS 노출 모델의 C57BL / 6 변형 쥐를 연구한다. CS 노출, 폐기종 및 작은기도의 섬유화 6 개월 후 야생 타입 개발 (WT) C57BL / 6 마우스, 두 병변은 심각도 (5, 10)에서 상대적으로 온화한. 코 전용 및 전신 노출 : 연구자들은 CS 노출의 두 가지 유형을 사용합니다. 1)이 더 노동 집약적 인 방법이다 : 코 전용 노출 기법의 주요 단점은 있습니다 2) 마우스 동물 (11)의 스트레스 반응과 온열 수를 유도 소실 구속되어야한다. (본원에 기재 됨) 전신 노출의 주요 단점은 털을 청소할 때 동물 니코틴 및 타르 제품 (또한 흡입 등) 섭취 할 수 있다는 것이다. 전신 CS 노출 된 마우스는 또한 낮은 헤모글로빈 수치가 코 전용 CS (12)에 노출 된 동물에 비해 체중의 손실을 감소시켰다.
<p class = "jove_content"> 폐 기능 검사 (PFT를) : 폐 준수 및 elastance의 조치는 일반적으로 C57BL / 6 야생형 비슷 (WT) 때문에 때를 개발 비교적 가벼운 기종에 6 개월 공기 또는 CS에 노출 된 쥐 변형은 CS (10)에 노출된다. 기종 파괴가 더 심한 경우 그러나, 폐 준수 및 압력 볼륨 (PV)에서 왼쪽 이동의 증가는 루프가 검출 될 수있다 흐른다. 후자는 C57BL / 6 WT 마우스보다 더 심한 폐기종 유형이 CS 노출 된 C57BL / 6 변형 유전자 타겟팅 마우스에서, CS의 효과 (10)에 더 민감하다 뮤린 균주, 예를 들면, 관찰 할 수있다 또는 CS의 효과 (14)에 더 민감들을 렌더링 환경 변화 실시 CS 노출 마우스 (13). 이 프로토콜은 조직에서 폐의 탄성 반동 (quasistatic 폐 준수 증가 [CST]의 감소와 감소를 측정 할 수있는 작은 동물 인공 호흡기를 사용elastance [H]), PV 흐름 루프, 마취 마우스 (15, 16)의기도와 조직 저항의 변화.폐기종의 측정 : 그 분포가 균질하지 않기 때문에 CS-노출 C56BL / 6 변형 생쥐에서 폐기종 개발의 분석은 도전이다. 몇 가지 다른 방법은 마우스의 영공 확대를 정량화. 사용 된 첫 번째 방법 (17)의 평균 선형 절편 (L의 m)이었다. 그러나, L의 m 방법은 (폐의 모든 부분이 무작위로 샘플링하지 않는 한) 질병 때문에 분석에 관찰자의 편견을 초래할 수있다 그것의 사용의 이질성을 캡처 할 수 있습니다 느린, 수동 프로세스입니다. 파괴 지수 [DI는, (18)]도 마톡 실린 및 에오신 염색 폐 부의 인쇄 수치화 된 영상 위에 균등하게 분산 배치 된 50 점의 투명 시트를 이용한 공역 확대 정량화. PI 방법 점수 각 지점 AC 주변 영역범위을 준수하여하는하는이 지역 내에서 폐포 덕트 및 폐포 벽은 파괴합니다. DI 방법의 주요 단점은 시간이 많이 소요되는 등의 방법 (19, 20)보다 더 정확하지 않다는 것이다.
이 프로토콜 조치 길의 얼룩 염색 파라핀 폐 섹션에 폐포 현의 길이와 폐포 영역을 의미한다. 형태 학적 소프트웨어 바이너리 이미지 폐 구간의 영상을 변환 (여기서 조직은 흰색과 공역 블랙)에 연결 한 다음, 수평 및 수직 라인 (코드)의 균일 한 그리드를 중첩 및 소프트웨어가 다음에 의해 식별 영역 내의 각 코드의 길이를 정량화 영공 같은 소프트웨어. 이 방법을 이용하면, 상대적으로 표준화되고 자동화 된 방법 (21)에 폐의 모든 부분에서 폐포의 크기를 측정 할 수있다.
작은기도 개형 (SAR) : ECM 단백질의 증가 증착 (특히 interstitia작은기도 주위 리터의 콜라겐)는 CS에 노출 된 동물에서 발생하고 방해 공기 흐름에 기여한다. 연구팀은 폐기종 개발 (22)로 자주 만성 폐쇄성 폐 질환의 동물 모델에서 SAR을 연구하지 않습니다. CS 노출 된 마우스의 SAR을 정량화하기 위해,이 프로토콜은 소기 파라핀 폐 섹션 (기도 300와 899m 사이의 평균 직경을 갖는) 주위에 증착된다 ECM 단백질의 층의 두께를 측정하는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 메이슨의 트리 크롬으로 염색하고.
Protocol
Representative Results
Discussion
Most researcher use mice to model the main chronic lung pathologies and abnormal lung physiology in COPD (airspace enlargement, SAR, and increases in lung compliance) present in the human disease. A comprehensive approach to assess the effect of molecules of interest on both emphysema development and SAR is needed in mice in order to comprehensively assess the activities of molecules of interest in these chronic disease processes.
There are several critical steps in this protocol. First, dur…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 문서에 대한 공로 프란체스카 Polverino MD, 브리검에서 연구 위원과 여성 병원을 감사드립니다, 또한 모니카 야오, BS, 케이트 라이 델, 쥐의 사육 및 담배 연기에 쥐를 노출 그들의 도움 BS.
이 작품은 보건 서비스, 국립 심장, 폐, 혈액 연구소 보조금 HL111835, HL105339, HL114501, 승무원 의학 연구소 그랜트 # CIA123046, 브리검 여성 병원 – 러브 레이스 호흡기 연구소 컨소시엄, 그리고 캠브리지 NIHR 바이오 메디컬에 의해 지원되었다 연구 센터.
Materials
| Whole-body smoke exposure device | Teague Enterprise | TE-10z | Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice |
| Research Cigarette | University of Kentucky | 3R4F reference cigarettes | |
| Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm | Pall Corporation | 7219 | For measurement of TPMs |
| 25 mm filter holder | Pall Corporation | ||
| Filter sampler | Intermatic | Metal T100 | |
| Gas meter | AEM | Gas meters G1.6; G2.5; G4 | |
| Tracheal Cannula for mouse 18 gauge | Labinvention | Analysis of pulmonary function | |
| Mechanical ventilator | Scireq | FlexiVent | |
| Gill's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GSH316 | For Gill staining, work under a fume hood |
| Hematoxylin solution, Harris modified | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
| Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | For analysis of emphysema |
| Scion Image Program | Scion Corporation | ||
| Mason's trichrome stain | Sigma-Aldrich | HT15 | For analysis of small airway fibrosis |
| MetaMorp Offline version 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |
Referenzen
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