光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）
Summary
細胞および組織中のタンパク質レベルは、多くの場合、緊密にタンパク質産生及びクリアランスのバランスによって調節される。光変換した後、蛍光減衰（FDAP）を使用して、タンパク質のクリアランス速度は、実験的にin vivoで測定することができる。
Abstract
タンパク質の安定性は、生物学の多くの側面に影響を与える、タンパク質のクリアランス速度を測定することは、生物学的システムへの重要な洞察を提供することができる。 FDAP実験では、生物内のタンパク質のクリアランスを測定することができる。目的のタンパク質は、photoconvertible蛍光タンパク質でタグ付けされ、インビボで発現され、photoconverted、経時photoconvertedシグナルの減少がモニターされる。データは、その後、タンパク質の半減期を決定するための適切なクリアランスモデルが取り付けられている。重要なのは、生物の異なる区画におけるタンパク質の集団のクリアランス動態コンパートメントマスクを適用することによって、別々に検査することができる。このアプローチは、ゼブラフィッシュの開発中に分泌されたシグナル伝達タンパク質の細胞内および細胞外の半減期を決定するために使用されてきた。ここでは、ゼブラフィッシュ胚におけるFDAP実験のためのプロトコルについて説明します。それのクリアランス速度を決定するFDAPを使用することが可能であるべきであるすべての光学的にアクセス可能な生物内の任意のタグ付けタンパク質。
Introduction
細胞および生物中のタンパク質のレベルは、製造及びクリアランス形成速度によって決定される。タンパク質半減期は数分から数日1-4の範囲とすることができる。多くの生物学的システムでは、重要なタンパク質の安定化またはクリアランスは、細胞活性に重要な影響を有している。細胞内のタンパク質の安定性の調節は、細胞周期の進行5,6、発達シグナリング7-9、アポトーシス10、および正常な機能およびニューロン11,12の維持に必要である。細胞外タンパク質の安定性は、組織内のモルフォゲン13,14、などの分泌タンパク質の分布と可用性に影響を与えます。
過去数十年にわたって、タンパク質の安定性は、主に放射パルス標識またはシクロヘキシミドチェイス実験15を使用して、細胞培養において評価されている。このようなパルスチェイス実験において、細胞を一過放射性アミノ酸の「パルス」に露出されている新たに合成されたタンパク質に組み込まれているか、又はそれらは、タンパク質合成を阻害するシクロヘキシミド、にさらされている酸前駆体。培養された細胞は、その後の異なる時点で、そしていずれかの免疫沈降は、（放射パルスチェイス実験において）、続いてオートラジオグラフィーまたはウェスタンブロッティング（シクロヘキシミド実験で）収集され、経時的タンパク質のクリアランスを定量化するために使用される。
従来のタンパク質安定性アッセイは、いくつかの欠点を有する。まず、これらのアッセイにおけるタンパク質は、しばしば、それらの内因性の環境において発現されるのではなく、異なる種由来の細胞組織培養において、時には。その安定性はコンテキスト依存であるタンパク質については、このアプローチには問題がある。第二に、時間をかけて、個々の細胞または生物におけるタンパク質のクリアランスに追従することができず、これらのアッセイからのデータは、異なる時点で細胞の異なる集団の平均を反映している。個々の細胞が開始している可能性があるのでタンパク質の異なる量、異なる時間に放射性標識またはシクロヘキシミドを取り上げてもよいし、異なるクリアランス速度を有していてもよく、そのような集計データは誤解を招く可能性がある。最後に、シクロヘキシミドチェイス実験の場合、タンパク質合成阻害剤の添加は、人為的にタンパク質の安定性16-18を変えることができ、意図しない生理学的効果を有することができる。これらの欠点は、光変換（FDAP）後に蛍光減衰を使用して（FDAP技術の限界のための説明を参照）、生物19-25で動的にタンパク質クリアランスを測定するためにphotoconvertibleタンパク質を利用して技術を避けることができる。
Photoconvertibleタンパク質は、その励起および発光特性は、光26の特定の波長に暴露された後に変更蛍光タンパク質である。 1つの一般的に使用される変形はDendra2、最初にEXを持つ「グリーン·ツー·赤」photoconvertibleタンパク質である緑色蛍光タンパク質と同様の引用及び発光特性が、UV光- 「光変換」 -そのへの曝露後に、励起/発光特性は、赤色蛍光タンパク質23,27と同様になる。重要なことは、光変換後に生成新しいタンパク質はphotoconvertedタンパク質の唯一のプールの光変換時の生産とクリアランスのデカップリングと観察を可能にphotoconvertedタンパク質と同じ励起/発光特性を持っていません。 photoconvertibleタンパク質と目的のタンパク質にタグを付けるため、そのまま、光学的にアクセス可能な生物中のタンパク質ラベルのパルスに便利な方法を提供します。
FDAPアッセイ（ 図1A）において、目的タンパク質はphotoconvertibleタンパク質でタグ付けされ、生体（ 図1B）で表さ。融合タンパク質はphotoconvertedされ、経時photoconvertedシグナルの減少はfluorescenによって監視されているCE顕微鏡（ 図1C）。データは、その後、融合タンパク質（ 図1D）の半減期を決定するために適切なモデルが取り付けられている。
ここで説明FDAPアッセイは、初期胚発生19時のゼブラフィッシュ胚における分泌されたシグナル伝達タンパク質の細胞外半減期を決定するために設計されました。しかし、このアプローチは、ライブイメージングを許容し、かつ任意のタグ付け、細胞内または細胞外タンパク質のクリアランスを監視するために使用することができる任意の透明なモデル生物に適合させることができる。ここに記載の技術の変形は、培養細胞20,23およびショウジョウバエ 22及びマウス21胚で行われている。
Protocol
Representative Results
Discussion
FDAP実験の成功は、機能的なphotoconvertible融合タンパク質の生成に依存している。タンパク質をタグ付けすると、その局在性、溶解性、および安定性36-41を含む、その生物学的活性および/ または生物物理学的特性に影響を与えることができる。アクティブなものを見つけるために、いくつかの異なる融合構築物の活性を試験するために調製すること。本発明者らは、目的のタンパ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、原稿上のコメントジェフリー·ファレル、ジェームズガニオン、そしてジェニファーバーグマンに感謝したいと思います。 KWRはFDAPアッセイの開発中に国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムによってサポートされていました。この作品は、AFSへとPMにドイツ研究財団（エミー·ネータープログラム）、マックス·プランク協会、とヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラム（キャリア開発賞）からの補助金によってNIHからの助成金によってサポートされていました。
Materials
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340) | To generate capped mRNA for injection into embryos | ||
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682) | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks | ||
| 6-well plastic dish (BD Falcon) | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | ||
| Embryo medium | 250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147) | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage | ||
| 5 cm diameter glass petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100) | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use | ||
| Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT) | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos | ||
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C) | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 | ||
| 15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | ||
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25x or 40x water objective | Objective for imaging | ||
| 10x air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
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