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Neurowissenschaften

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

Published: January 10, 2015
doi:
10.3791/52358
, ,
1Institute of Neuroscience and Medicine (INM-2),Research Centre Jülich, 2Department of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical Faculty, JARA,RWTH Aachen University

Summary

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Abstract

A combinação de gravações de patch clamp de dois (ou mais) neurónios sinapticamente acoplados (gravações emparelhados), em preparações de fatias cerebrais agudos com simultânea enchimento biocitina intracelular permite uma análise correlacionada das suas propriedades estruturais e funcionais. Com este método, é possível identificar e caracterizar os neurônios pré e pós-sinápticos pela sua morfologia e padrão de resposta eletrofisiológica. Gravações emparelhadas permitem estudar os padrões de conectividade entre estes neurónios, bem como as propriedades de ambos transmissão sináptica química e eléctrica. Aqui, vamos dar uma descrição passo-a-passo dos procedimentos necessários para obter gravações emparelhados confiáveis, juntamente com uma ótima recuperação da morfologia neurônio. Vamos descrever como pares de neurônios conectados via sinapses químicas ou junções comunicantes são identificados em preparações fatia cérebro. Vamos delinear como os neurônios são reconstruídos para obter sua morfologia 3D da Dendritic e domínio axonal e como contatos sinápticos são identificadas e localizadas. Também vamos discutir as ressalvas e limitações da técnica de gravação emparelhado, em especial os associados truncations dendríticas e axonais durante a preparação de fatias do cérebro, porque estes afetam fortemente as estimativas de conectividade. No entanto, devido à versatilidade da abordagem gravação emparelhado irá permanecer um instrumento valioso na caracterização de diferentes aspectos da transmissão sináptica no microcircuitos identificados neuronais no cérebro.

Introduction

Microcircuitos neuronais entre dois neurônios synaptically acoplados são os blocos de construção de redes de grande escala no cérebro e são as unidades fundamentais do processamento de informações sináptica. Um pré-requisito para a caracterização de tais microcircuitos neuronais é conhecer a morfologia e as propriedades funcionais de ambos os neurónios parceiros pré e pós-sinápticos, o tipo de conexão sináptica (s) e a sua estrutura e mecanismo funcional. No entanto, em muitos estudos de ligações sinápticas, pelo menos, um dos neurónios em um microcircuito não está bem caracterizada. Isto resulta a partir dos protocolos de estimulação relativamente não específicos, muitas vezes utilizados em estudos de conectividade sináptica. Portanto, as propriedades estruturais e funcionais do neurónio pré-sináptico quer não são identificadas em todos ou apenas a um pequeno grau (ou seja, a expressão de proteínas marcadoras etc.). Gravações emparelhados em combinação com coloração intracelular por marcadores such como biocitina, neurobiotin ou corantes fluorescentes são mais adequados para o estudo de pequenas microcircuitos neuronais. Esta técnica permite investigar muitos parâmetros estruturais e funcionais de uma conexão sináptica identificadas morfologicamente, ao mesmo tempo.

Os chamados conexões monosinápticos «unitária» entre dois neurônios têm sido investigados em ambas as regiões cerebrais corticais e subcorticais 10/01 usando preparações fatia agudas. Inicialmente, microeléctrodos afiados foram usadas nestas experiências; mais tarde, a gravação de patch clamp foi utilizada a fim de obter gravações de sinais sinápticos com um nível de ruído mais baixo e uma resolução temporal melhorada.

Um avanço técnico significativo foi o uso de diferencial de infravermelho interferência contraste (IR-DIC) óptica 11-14, uma técnica microscópica que melhorou significativamente a visibilidade e identificação de neurônios na fatia do cérebro, de modo que se tornou possível to de obter gravações de visualmente identificados conexões sinápticas 15-17. Em geral, as gravações emparelhados são feitas em preparações de fatias agudas; só muito poucas publicações são gravações de relatórios disponíveis de neurônios conectados synaptically in vivo 18-20.

A vantagem mais importante das gravações emparelhados é o facto de que uma caracterização funcional pode ser combinada com uma análise morfológica, tanto a luz e electrões nível microscópico (ver por ex., 7,16,21). Após o processamento histoquímica, a morfologia dendrítica e axonal do par neurônio synaptically conectado é rastreado. Subsequentemente, é possível quantificar características morfológicas, tais como comprimento, densidade espacial, orientação, padrão de ramificação, etc. Estes parâmetros podem então proporcionar uma base para a classificação objectiva de uma conexão sináptica específico. Além disso, em contraste com a maioria das outras técnicas utilizadas para estudar connecti neuronaisvidade, emparelhado gravações também permitir a identificação dos contatos sinápticos para conexões sinápticas unitários. Isso pode ser feito diretamente, usando uma combinação de luz e microscopia eletrônica 16,21-27 ou usando imagens de cálcio 28,29 das espinhas dendríticas. No entanto, com esta última abordagem só excitatório, mas não conexões inibidoras pode ser estudada como requer o influxo de cálcio através dos canais dos receptores pós-sinápticos.

Além de uma análise detalhada da transmissão sináptica em um microcircuito emparelhado gravações neuronais definidas também permitem o estudo das regras de plasticidade sináptica 30,31 ou – em combinação com a aplicação de agonista / antagonista – a modulação da transmissão sináptica por neurotransmissores tais como acetilcolina e 32 adenosina 33.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados em conformidade com a Directiva da União Europeia para a Protecção dos Animais, o Animal Welfare Act Alemã (Tierschutzgesetz) e as Diretrizes da Federação de Associação de Ciência Animal Laboratório Europeu. 1. Set-up de Eletrofisiologia Antes de começar com a gravação emparelhado, um eletrofisiologia set-up tem que ser construído. Um breve esboço como tal set-up é montado é dado abaixo: <ol…

Representative Results

Gravações emparelhados são o método de escolha para uma caracterização detalhada das conexões sinápticas uni ou bidirecionais morfologicamente identificadas, bem como a junção da diferença conexões (elétricas) (Figura 1). Um exemplo de uma gravação emparelhado na camada 4 do córtex somatossensorial tambor é mostrado na Figura 1A. Ambos excitatório unidireccional e conexões sinápticas inibidoras pode ser caracterizado (Figura 1B, C). Além disso grava…

Discussion

Gravações pares de excitatório sinapticamente acoplados e / ou os neurónios inibitórios são uma abordagem muito versátil para o estudo de microcircuitos neuronais. Não só esta abordagem permitem estimar conectividade sináptica entre os tipos de neurônios, mas também permite determinar as características funcionais da conexão e da morfologia dos neurônios pré e pós-sinápticos. Além disso, agonista e / ou antagonista pode ser facilmente aplicado aos neurónios em preparações de fatias. Isto permite es…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank all members of ‘Function of Neuronal Microcircuits’ Group at Institute of Neuroscience and Medicine, INM-2, Research Centre Jülich and the ‘Function of Cortical Microcircuits’ Group in the Dept. of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical School, JARA, RWTH Aachen University for fruitful discussions. This work was supported by the DFG research group on Barrel Cortex Function (BaCoFun).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier HEKA EPC 10 USB Triple with 2-3 preamplifiers
Microscope Olympus BX51WI with 2 camera ports and a 4× objective, a 40× water-immersion objective
Camera TILL Photonics VX55 infrared CCD camera
Workstation Luigs & Neumann Infrapatch 240 with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope
Micromanipulator Luigs & Neumann SM-5 x-y-z manipulators for 2-3 preamplifiers
Faraday cage Luigs & Neumann
Anti-vibration table Newport Spectra-Physics
Patchmaster HEKA
Microtome Microm International HM650V
Micropipette puller HEKA Sutter P-97
Neurolucida system Microbrightfield with Neurolucida and Neuroexplorer softwares
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Keywords: Paired Patch-clamp RecordingAcute Brain SliceNeuronal MicrocircuitsSynaptic TransmissionElectrophysiologyMorphologyConnectivityChemical SynapsesGap JunctionsNeuron ReconstructionDendritic TruncationAxonal Truncation
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Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358, doi:10.3791/52358 (2015).
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