Die Untersuchung medullärer Thymusepithelzellen in vitro war weitgehend erfolglos, da aktuelle 2D-Kultursysteme das in vivo-Szenario nicht nachahmen. Das hierin beschriebene 3D-Kultursystem - ein modifiziertes organotypisches Hautkulturmodell - hat sich bei der Rekapitulation der mTEC-Proliferation, Differenzierung und Aufrechterhaltung der promiskuitiven Genexpression als überlegen erwiesen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Intra-Thymus-T-Zell-Entwicklung erfordert ein kompliziertes dreidimensionales Maschenwerk aus verschiedenen Stromazellen, dh Nicht-T-Zellen. Thymocyten durchqueren dieses Gerüst in einem hoch koordinierten zeitliche und räumliche Ordnung, während sequentiell vorbei obligatorischen Kontrollpunkte, dh T-Zelllinie Engagement, gefolgt von T-Zell-Rezeptor-Repertoire und Auswahl vor der Ausfuhr in die Peripherie. Die beiden wichtigsten ansässigen Zelltypen bilden dieses Gerüst sind kortikalen (CTEC) und Mark Thymusepithelzellen (mTEZ). Ein Schlüsselmerkmal der mTEZ ist die sogenannte Promiscuous Expression zahlreicher gewebe beschränkten Antigenen. Diese gewebe beschränkten Antigenen präsentiert werden, um Thymozyten direkt oder indirekt durch unreife mTEZ oder Thymus-dendritische Zellen, die jeweils resultierenden Selbsttoleranz.
Geeignete in vitro Modelle emuliert die Entwicklungswege und Funktionen der CTEC und mTEZ liegen noch lacKönig. Dieser Mangel an angemessenen experimentellen Modellen hat zum Beispiel beeinträchtigt die Analyse der Promiscuous Genexpression, die immer noch schlecht auf zellulärer und molekularer Ebene verstanden wird. Wir angepasst 3D organotypischen Co-Kultur-Modell zur Kultur ex vivo isolierten mTEZ. Dieses Modell wurde ursprünglich entwickelt, um Keratinozyten derart zu kultivieren, um eine Hautäquivalents in vitro zu erzeugen. Das 3D-Modell beibehalten wichtigsten Funktionsmerkmale mTEC Biologie: (i) die Proliferation und terminale Differenzierung von CD80 lo, Aire-negative in CD80 hallo, Aire-positive mTEZ, (ii) Reaktionsfähigkeit auf RANKL, und (iii) nachhaltige Ausdruck FOXN1, Aire und gewebe eingeschränkt Gene in CD80 hallo mTEZ.
Einleitung
Entwicklung von Thymozyten machen etwa 98% des Thymus, die restlichen 2% bestehen aus einer Vielzahl von Zellen, die zusammen bilden den Thymus-Stroma (dh Epithelzellen, dendritischen Zellen, Makrophagen, B-Zellen, Fibroblasten, Endothelzellen). Die äußeren kortikalen Epithelzellen (CTEC) beschaffen Einwanderung von Pro-T-Zellen aus dem Knochenmark, T-Zell-Linie Induktion in multi pre-T-Zellen und positive Selektion von selbst MHC beschränkt unreifen Thymozyten. Die inneren Mark Thymusepithelzellen (mTEZ) in Toleranzinduktion dieser Thymozyten mit einer hochaffinen TCR Selbst Peptid / MHC-Komplexen durch entweder induzierende negative Selektion oder deren Ab....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Regierungspräsidium Karlsruhe zugelassen. Alle Tiere wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen am Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) untergebracht ist. Für alle Kulturexperimenten Maus Jungtieren, die von 1 bis 7 Tage alt verwendet.
1. Isolierung von mTEZ aus Thymus
HINWEIS: Die folgenden Schritte Verdauung wurden wie zuvor 1 unter sterilen Bedingungen mit einigen Modifikationen wie folgt beschrieben durchgeführt.
- Enthaupten die Maus Welpen und nehmen Sie den Thymus. Setzen Sie den Thymi auf Eis in einer Petri Platte mit RPMI ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Wir nahm eine 3D organotypischen Co-Kultur-Modell (3D OTC), die ursprünglich für die in-vitro-Langzeitkultur von Keratinozyten 9 entwickelt hatte. MACS-angereicherten mTEZ (siehe MACS Anreicherung Schema Abbildung 1) wurden auf ein Gerüst aus einer Fibrin-Gel und eingeschlossene Fibroblasten ausgesät. Die Fibroblasten stellen die wesentlichen extrazellulären Matrix (ECM), welche mTEZ in vitro. MTEZ wurden in OTCs für 4-14 Tage in Gegenwart von RANKL in Submerskulturen Gegens.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Neben RTOCs, haben die 3D-OTCs weit überlegen in Bezug auf die TEC Differenzierung und PGE Wartung / Induktion (Tabelle 1) im Vergleich zu anderen (i) "vereinfachte 3D-Kulturen" mit Hilfe gewesen - Fibroblasten allein, ohne das Gerüst; (Ii) 2D-Systeme mit - Fibroblasten / Feeder-Zellen co-kultiviert mit TECs 10, (iii) 3T3-J2-Zellen bei TEC Klone zu entwickeln, aber pGE verloren geht, (iv) Matrigel oder (v) ECM-Komponenten (unveröffentlichte Daten). PGE wurde für bis zu 7 Tage in der.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, keine finanzielle oder kommerzielle Interessenkonflikt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Deutsche Krebsforschungszentrum (DKFZ), das EU-Konsortium "Tolerage", die Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) und die Landesstiftung Baden-Württemberg.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Trächtige C57BL/6 Mäuse | Charles River WIGA | ||
| LS Säulen | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MS Säulen | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| CD45 Mikrokügelchen, Maus | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Anti-PE Mikrokügelchen | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Streptavidin Mikrokügelchen | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| EpCAM (G8.8 -Alexa 647 und -biotin) | Ref. 12 | ||
| CD80-PE Antikörper | BD Pharmingen | 553769 | |
| CD45-PerCP Antikörper | BD Pharmingen | 557235 | |
| Ly51-FITC Antikörper | BD Pharmingen | 553160 | |
| CDR1-Pacific Blue | Ref. 15 | ||
| Keratin 14 Antikörper | Covance | PRB-155P | |
| Vimentin Antikörper | Progen | GP58 | |
| Cy3-konjugiertes AffiniPure Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-003 | |
| Alexa 488-konjugiertes AffiniPure F(ab')2 Fragment Ziege Anti-Meerschweinchen IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 106-546-003 | |
| Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 Konjugat | Molekulare Sonden (Invitrogen GmbH) | A-11008 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Invitrogen | C10339 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Durchflusszytometrie Assay Kit | Invitrogen | C10425 | |
| 12-Well-Filtereinsätze (thincerts) | Greiner bio-one | ||
| 12-Well-Platte | Greiner | 665180-01 | |
| Jettex 2005/45 | ORSA, Giorla Minore, Italien | ||
| Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| PBS | Serva | 47302.03 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| DMEM/F12 | Lonza | BE12-719F | |
| HEPES | Gibco | 15630-049 | |
| FBS Gold | GE Healthcare | A11-151 | |
| Aprotinin (Trasylol) | Bayer | 4032037 | |
| Choleratoxin | Biomol | G117 | |
| Hydrocortison | Seromed (Biochrom) | K3520 | |
| L-Ascorbinsäure | Sigma | A4034 | |
| TGF-ß 1 | Invitrogen | PHG9214 | |
| RANKL | R& D systems | 462-TR-010 | |
| Thermolysin | Sigma Aldrich | T-7902 | |
| OCT Compound | TissueTek | 4583 | |
| Trizol (aka. Denaturierungslösung - Saure Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion) | Invitrogen | 10296028 | |
| FastPrep FP120 | Thermo Scientific | ||
| Kollagenase Typ IV | CellSystems | LS004189 | 0,2 mg/ml und 57U/ml Endkonz. |
| Neutrale Protease (Dispase) | CellSystems | LS002104 | 0,2 mg/ml und 1,2 U/ml Endkonz. |
| DNase I | Roche | 11 284 932 001 | 25 & Mikro; g/ml Endkonz. |
Referenzen
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
