העשרת תא אוטומטית של ציטומגלווירוס ספציפי תאי T ליישומים קליניים באמצעות מערכת ציטוקין ללכוד
Summary
The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.
Abstract
העברת המאמצת של תאי T ספציפי לפתוגן יכול לשמש כדי למנוע ולטפל בזיהומים אופורטוניסטים כגון ציטומגלווירוס (CMV) זיהום המתרחשים לאחר השתלת תאי גזע hematopoietic אלוגנאית. תאי T ויראלי הספציפיים מתורמים אלוגנאית, כוללים תורמי צד שלישיים, יכולים להיות מופצים vivo לשעבר בעמידה בפרקטיקת ייצור טובה הנוכחית (cGMP), העסקת סיבובים חוזרים ונשנים של גירוי מונע אנטיגן כדי להפיץ באופן סלקטיבי תאי T רצויים. זיהוי והבידוד של תאי T אנטיגן ספציפי יכולים גם להתבצע על בסיס מערכת לכידת ציטוקינים של תאי T שהופעל להפריש אינטרפרון גאמה (IFN-γ). עם זאת, יישום אנושי נרחב של מערכת לכידת ציטוקינים (CCS) כדי לעזור להחזיר את החסינות הוגבל כתהליך הייצור הוא זמן רב ודורש מפעיל מיומן. הפיתוח של מכשיר להעשרת תאי דור שני כגון CliniMACS Prodigy עכשיומאפשר לחוקרים ליצור תאים נגיפיים ספציפיים T באמצעות מערכת עתירת עבודה אוטומטית, פחות. מכשיר זה מפריד כותרת מגנטית תאים מהתאים ללא תווית באמצעות טכנולוגיית תא מופעלת מגנטית מיון כדי ליצור מוצרים ברמה קלינית, מתוכנן כמערכת סגורה, וניתן לגשת ומופעל על benchtop. אנו מדגימים את הפעולה של מכשיר העשרת תא האוטומטי החדש לייצור תאי T CMV pp65 הספציפי המתקבלים ממוצר apheresis מצב יציב שהתקבל מתורם נגוע מחשבת CMV. תאי T המבודדים אלה לאחר מכן ניתן חדורים ישירות לתוך מטופל תחת פיקוח רגולטורים מוסדי והפדרלי. כל שלבי העיבוד ביו כולל ההסרה של תאי דם אדומים, גירוי של תאי T, תאי הפרדת אנטיגן הספציפי T, הטיהור, והשטיפה אוטומטיים לחלוטין. התקנים כגון זה מעלים את האפשרות שתאי T ליישום אנושי יכולים להיות מיוצרים מחוץ לתרגול ייצור טוב ייעודי (GMP) מתקנים ובמקום להיות מיוצרים במתקני בנקאות דם בו צוות יכול לפקח פרוטוקולים אוטומטיים לייצר מספר רב של מוצרים.
Introduction
השתלת hematopoietic תאי גזע (HSCT) 1 יכולה להיות משולבת עם טיפול T-cell מאמץ כדי לשפר את השפעת השתל נגד גידול ולספק חסינות לזיהומים אופורטוניסטיים 2. דור של תאי T תורם נגזרות אנטיגן ספציפי לעירוי דרש היסטורי אנשים ושימוש במתקנים מיוחדים שGMP תואם מיומנים. המשלוח של תאי T כזה הביא רזולוציה של זיהומים אופורטוניסטים 3, כמו גם טיפול בממאירות בסיס 4. לאחרונה, חוקרים הראו כי העברת המאמצת של כמה אלף רק תאי T וירוס ספציפי (~ 1 x 10 4-2.5 x 10 5 תאים / משקל גוף נמען קילוגרם) יכול לטפל בהצלחה בזיהומים CMV אופורטוניסטיים לאחר אלוגנאית HSCT 5-9. מספר מוגבל של מתקני GMP עם דרישות ייצור מיומנות הקשורים והעלות הגבוהה הקשורים בייצור תאים יש, עם זאת, restrגישה סבלנית icted למבטיח T-cell טיפולים 10. גישה אחת לבידוד תאי T אנטיגן הספציפי מבוססת על CCS באמצעות מגיב דו-ספציפי להכיר CD45 וIFN-γ. כפי שמוצג, מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי ליצור תאי T כיתה קלינית CMV ספציפי העסקת מכשיר CCS העשרת תא אוטומטי (איור 1).
תאי T CMV ספציפי שנוצרו על ידי דוגרים פפטידים חופפים מאנטיגן pp65 CMV עם תאי leukapheresis כולל גרעיניים (TNC) מתורמים CMV-נגועים מחשבה. פפטידים אלה, מוצגים בהקשר של אנטיגן לויקוציטים האנושי (HLA), להפעיל את תאי T pp65 הספציפי CMV בתוך TNC להפריש IFN-γ. תאי T אלה לאחר מכן ניתן "נתפסו" ונפרדו מגנטיים. הפעולה של המכשיר להעשרת תאי הדור הראשון (איור 1 א) נדרשה כוח אדם מיומן בתרבית תאים בתנאי GMP, ותיאום של צוות לבצע את ים מרובהteps צורך ליצור מוצר "נתפס".
ההליך נדרש בדרך כלל 10 עד 12 שעות של פעולה רציפה, ולכן אנשים סביר צריכים לעבוד על שתי משמרות במתקן GMP. אילוצים אלה כעת בטל על ידי היישום של מכשיר דור שני (מוצג באיור 1). מכשיר זה מתחייב העשרה מגנטית, בדומה למכשיר הדור הראשון, אבל לאוטומטי היבטים אחרים של CCS בגישת unbreached. זה מפחית באופן משמעותי את העומס על צוות GMP כמו רוב השלבים יכולים להתבצע ללא השגחה על ידי צוות. יתר על כן, מאז המכשיר פועל כמערכת סגורה, יכולים להיות שנתפסו תאי T אנטיגן ספציפי ומעובד על benchtop מלבד השלבים כרוכים בבידוד leukapheresis והכנה של חומרים לפני שמתחיל את המכשיר. פרטים של המכשור והפונקציונליות של מכשיר העשרת תאי דור שני זה מלא כבר מסבאותlished 11.
כאן, אנו מתארים את הצעדים להעשיר תאי T pp65 הספציפי CMV ממוצר apheresis מצב יציב באמצעות מערכת CCS העשרת תא האוטומטית. ברגע בודד, תאי T CMV ספציפי אלה עשויים להיות חדורים באופן מיידי למטופל.
Protocol
Representative Results
Discussion
טיפול T-cell מאמצת התפתח כאפשרות מעשית לטיפול בגידולים ממאירים B-cell 4. הפוטנציאל הטיפולי שלה תלוי ביציקת המספר הרצוי של תאי T ספציפיים לאנטיגן היעד שחסר replicative הזדקנות 2. זו יכולה להיות מושגת על ידי מיון אוכלוסייה טהורה של תאי T ספציפיים לאנטיגן מתאי T התרחבו בע…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.
Materials
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 mL Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/mL) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
Referenzen
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst’s Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
- Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
- Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), 55-59 (2014).
- Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
- Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
- Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
- Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
- Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
- Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
- Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
- Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
- Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
- Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).
