Abstract
सिंथेटिक सामग्री संवहनी विकल्प के रूप में प्रत्यारोपित जब इस तरह की सूजन, एक प्रकार का रोग है, और संक्रमण के रूप में नैदानिक जटिलताओं आरंभ करने के लिए जाना जाता है। कोलेजन के कारण अपने निहित biocompatibility के लिए बड़े पैमाने पर जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया गया है और सिंथेटिक सामग्री के लिए एक वैध विकल्प माना जाता है (यानी, कम प्रतिजनकता, सूजन, और साइटोटोक्सिक प्रतिक्रियाएं)। हालांकि, सीमित यांत्रिक गुणों और कोलेजन जैल से संबंधित कम हाथ-क्षमता संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग के लिए पाड़ सामग्री के रूप में उनके उपयोग के आड़े आती है। इसलिए, इस काम के पीछे तर्क चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं से संभाला जा करने के लिए पर्याप्त कठोर ऊतकों प्राप्त करने के लिए कोलेजन मैट्रिक्स के संचालित पुनर्गठन को बढ़ाने के लिए एक ट्यूबलर के आकार का ज्यामिति और दूसरे में cellularized कोलेजन जैल इंजीनियर करने के लिए पहली बार था।
यहाँ वर्णित रणनीति एक 3 डी cyli में कोलेजन और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (निर्माण) के प्रत्यक्ष संयोजन पर आधारित हैएक मोल्डिंग तकनीक के उपयोग के साथ ndrical ज्यामिति। इस प्रक्रिया को 1 या 2 सप्ताह के लिए (एप्लाइड बाहरी गतिशील यांत्रिक बाधाओं के बिना) निर्माणों स्थिर शर्तों के तहत एक बायोरिएक्टर में संवर्धित कर रहे हैं, जिसके दौरान एक परिपक्वता अवधि की आवश्यकता है। "स्थैतिक बायोरिएक्टर" निर्माणों के लिए एक निगरानी और नियंत्रित बाँझ वातावरण (पीएच, तापमान, गैस विनिमय, पोषक तत्वों की आपूर्ति और कचरे को हटाने) प्रदान करता है। संस्कृति अवधि के दौरान, मोटाई माप मैट्रिक्स कोलेजन की कोशिकाओं संचालित remodeling के मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शन किया गया है, और ग्लूकोज की खपत और लैक्टेट उत्पादन दर कोशिकाओं चयापचय गतिविधि पर नजर रखने के लिए मापा गया। अंत में, यांत्रिक और viscoelastic गुण जिसके परिणामस्वरूप ट्यूबलर निर्माणों के लिए मूल्यांकन किया गया। यह अंत, विशिष्ट प्रोटोकॉल और एक केंद्रित पता है कि कैसे (हेरफेर, इतने पर, मनोरंजक हाइड्रेटेड वातावरण में काम कर रहे हैं, और) करने के लिए इंजीनियर के ऊतकों को चिह्नित करने के लिए विकसित किए गए।
Introduction
संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग सिंथेटिक scaffolds के, सेल चादर आधारित ऊतक इंजीनियर रक्त वाहिकाओं (TEBVs), और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के आधार पर ग्राफ्ट सहित इंजीनियर वाहिकाओं के निर्माण, के उद्देश्य से विभिन्न रणनीतियों घटक आधारित TEBVs कल्पना करते हैं। इन तरीकों के अलावा, सिंथेटिक पॉलिमर अच्छा यांत्रिक गुणों का प्रदर्शन है, लेकिन वे bioactivity 1 कमी के रूप में एक आम दोष यह साझा करें। सेल चादर आधारित पद्धति उच्च यांत्रिक गुणों के साथ इंजीनियर संवहनी के विकल्प के उत्पादन की अनुमति देता है, लेकिन इस तरह के ग्राफ्ट का उत्पादन करने के लिए आवश्यक समय लगभग 28 सप्ताह 2 है। ऐसे कोलेजन, elastin, आतंच 3 या एक संयोजन के रूप में ईसीएम के प्राकृतिक जैवपॉलिमरों, तो तत्संबंधी, ऊतक इंजीनियरिंग scaffolds के लिए स्वर्ण मानक सामग्री रहते हैं। यह मुख्य रूप से कार्यात्मक सेलुलर प्रतिक्रियाओं 4-5 प्रेरित करने के लिए सक्षम किया जा रहा है, जबकि इन सामग्रियों को एक आम तौर पर अच्छा biocompatibility के अधिकारी उस कारण के लिए है। इन biopolymer के बीचएस, मैं कोलेजन टाइप ऐसी त्वचा, रक्त वाहिकाओं और tendons के रूप में कई ऊतकों में ईसीएम के सबसे प्रचुर मात्रा में है और प्रमुख लोड असर प्रोटीन में से एक है। व्यापक काम कोलेजन 6 के यांत्रिक गुणों पर आयोजित किया गया है - 8, लेकिन स्थिर परिपक्वता के दौरान कोलेजन जैल के सेलुलर remodeling पर केवल कुछ ही अध्ययन किया गया है। सेलुलर remodeling के कोलेजन तंतुओं नेटवर्क 9 की स्थिरता को प्रभावित कर सकता है कि कोशिकाओं द्वारा प्रेरित मैट्रिक्स कोलेजन की संरचनात्मक संशोधनों को दर्शाता है। एक प्राकृतिक पाड़ के रूप में, प्रकार मैं कोलेजन की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में, अलग-थलग निष्फल और इस तरह के चूहे की पूंछ tendons के रूप में 10 विभिन्न स्रोतों से संग्रहित किया जा सकता है। कोलेजन के साथ बातचीत सेलुलर और cellularized कोलेजन scaffolds के (निर्माणों) के संबंधित समग्र यांत्रिक व्यवहार को समझना ऊतकों के निर्माण के लिए एक आवश्यक कदम है। कोलेजन आधारित TEBVs सीधे कोलेजन के साथ कोशिकाओं के मिश्रण से संसाधित किया जा सकता हैजेल की तैयारी के दौरान और आगे इस तरह ट्यूबलर और तलीय 11 के रूप में विशिष्ट आकार में ढाला। जैल अंदर नाड़ी कोशिकाओं पैदा करना और फिर से तैयार करना प्रकार मैं 12 कोलेजन। इस प्रकार, इस विधि ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए scaffolds के विकास में महत्वपूर्ण मुद्दों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है कि विशिष्ट macroporosity के लिए की जरूरत को नजरअंदाज। हालांकि, कोलेजन जैल के प्रमुख कमियां उनके कम यांत्रिक गुणों सिंथेटिक सामग्री 13 की तुलना में कर रहे हैं।
इस अध्ययन में, कोशिकाओं के समरूप वितरण के साथ एक व्यवहार्य ऊतक एक एक कदम प्रक्रिया में कोशिकाओं के साथ कोलेजन के प्रत्यक्ष मिश्रण से इंजीनियर था। "स्थैतिक बायोरिएक्टर" (लागू किया बाहरी गतिशील यांत्रिक बाधाओं के बिना) cellularized कोलेजन जैल के स्थिर परिपक्वता की 1 या 2 सप्ताह के लिए इस्तेमाल किया गया। संस्कृति के दौरान, कोलेजन मैट्रिक्स remodeling इस प्रकार निर्माणों के लिए संरचनात्मक सुदृढीकरण प्रदान करने, आई। इसके अलावा, इन निर्माणों R थेEady एक घूर्णन दीवार बायोरिएक्टर को हस्तांतरित करने और एक समरूप अन्तःचूचुक हासिल की थी। इसके अलावा, इस काम में एक विशिष्ट यांत्रिक परीक्षण प्रोटोकॉल भी ट्यूबलर नरम ऊतकों के यांत्रिक गुणों निस्र्पक में एक उपयुक्त उपन्यास दृष्टिकोण प्रदान करने का प्रस्ताव है।
सारांश में, इस काम में इन विट्रो तेजी से निर्माण और जैविक और यांत्रिक अभिलक्षण के लिए, लेकिन यह भी एक महत्वपूर्ण माना जाता है, जो एक गतिशील बायोरिएक्टर में आगे यांत्रिक कंडीशनिंग, के लिए न केवल नियंत्रित किया जाना काफी मजबूत हैं कि संवहनी ऊतकों की परिपक्वता के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है ऊतकों के उत्थान में कदम।
Protocol
स्टेटिक bioreactor के 1. निर्माण और विधानसभा
- जलाशय का निर्माण
- बायोरिएक्टर के लिए एक संस्कृति के माध्यम से जलाशय के रूप में 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब तैयार करें।
- क्रमश: 20 नीचे से मिमी और जलाशय के शीर्ष पर दो 5 मिमी व्यास छेद ड्रिलिंग द्वारा दो बंदरगाहों बनाओ। फिर 5 मिमी लंबाई सिलिकॉन ट्यूब में दो luer फिटिंग डालें। छेद के माध्यम से इन luer फिटिंग प्रेस फिट है, और चिकित्सा ग्रेड सिलिकॉन गोंद के साथ सभी कनेक्शनों को सील।
- जलाशय (चित्रा 1 ए) के ऊपरी पोर्ट में 0.22 माइक्रोन फिल्टर डालें।
- जलाशय (चित्रा 1 ए) के निचले पोर्ट में एक luer पट डालें।
- खराद का धुरा टोपी विधानसभा
- Aerating छेद को शामिल किया गया है कि फिल्टर झिल्ली को नुकसान पहुँचाए बिना जलाशय ट्यूब के हवादार टोपी के केंद्र में एक 4.5 मिमी व्यास छेद ड्रिल।
- एक हलचल पट्टी तैयार करें (व्यास = 4.5 मिमी, लंबाई = 100 मिमी) निर्माण के लिए एक खराद का धुरा के रूप में।
- दो सिलिकॉन शंक्वाकार Stoppers (लंबाई = 10 मिमी, मध्य छेद व्यास = 4.5 मिमी) तैयार करें।
- चित्रा 1 बी में वर्णित के रूप में खराद का धुरा और टोपी (खराद का धुरा-कैप जटिल) इकट्ठे।
- छेद में खराद का धुरा प्रेस फिट बैठते हैं। टोपी उन दोनों के बीच फिट है कि इतना खराद का धुरा पर 2 stoppers के डालें। अपनी उपयोगी लंबाई 78 मिमी है कि इतनी खराद का धुरा की स्थिति को समायोजित करें।
- एक साथ टोपी और सिलिकॉन शंक्वाकार stoppers के शामिल होने से पहले संपर्क में हो जाएगा कि सतहों के लिए एक किताब और उसके बाद चिकित्सा ग्रेड सिलिकॉन गोंद लागू करें। टोपी पर अतिरिक्त गोंद निकालें।
- 1-3 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर इसे सूखा।
- धुंध पकड़ती का निर्माण
- 3 सिलिकॉन ट्यूब (:;: व्यास = 6.4 मिमी, लंबाई = 10 मिमी, और ट्यूब 3: व्यास = 3.1 मिमी, लंबाई = 12 मिमी ट्यूब 2 भीतरी व्यास = 6.4 मिमी, लंबाई = 5 मिमी ट्यूब 1) तैयार करें।
- वर्णन के रूप में धुंध पकड़ती इकट्ठेचित्रा 1C में डी।
- कट ट्यूब 1 अनुलंबीय, 2 ट्यूब पर इसे खोलने के लिए और सिलिकॉन गोंद के साथ उन्हें एक साथ चिपके रहते हैं।
- 5 सेमी x 7 सेमी की चादर बाँझ शल्य धुंध काटा, और फिर धुंध के सबसे लंबे समय तक पक्ष के साथ ट्यूब पर 3 कसकर धुंध रोल। धुंध से अधिक ट्यूब 1-ट्यूब 2 जटिल डालें।
- 8 मिमी की लंबाई में एक साथ धुंध, ट्यूब 1-ट्यूब 2 जटिल और ट्यूब 3. कट धुंध छड़ी करने के लिए सिलिकॉन गोंद जोड़ें।
- विधानसभा और नसबंदी
- चित्रा 2 में वर्णित के रूप में खराद का धुरा-कैप जटिल और धुंध पकड़ती इकट्ठे।
- कोट चिकित्सा ग्रेड तेल (2A चित्रा) के साथ खराद का धुरा। खराद का धुरा (चित्रा 2 बी) के ऊपर धुंध पकड़ती रखें। एक दूसरे से 35 मिमी के निर्धारित मूल्य पर पकड़ती दूरी।
- (एक मेज देखा (अंतिम लंबाई = 8 मिमी) का उपयोग कर एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के नीचे हिस्से को हटाने के द्वारा एक ट्यूबलर ढालना तैयार करें
- धुंध पकड़ती सुसज्जित खराद का धुरा-कैप विधानसभा (आवास-मोल्ड जटिल) से अधिक ढालना डालें, स्नैप-ढाले सिलिकॉन डाट (चित्रा -2) पर ढालना।
- जलाशय और आवास-मोल्ड जटिल आटोक्लेव।
नोट: अपनी टुकड़ी से बचने के लिए ढालना डालने जब कसकर सिलिकॉन डाट पर धारण करने के लिए सावधान रहें।
- चित्रा 2 में वर्णित के रूप में खराद का धुरा-कैप जटिल और धुंध पकड़ती इकट्ठे।
2. इंजीनियरिंग चिकनी पेशी सेल कोलेजन जेल आधारित constructs और स्टेटिक परिपक्वता
- इंजीनियरिंग Constructs
- Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम से मिलकर पूरी संस्कृति के माध्यम से 20 मिलीलीटर के साथ भरा 175 सेमी 2 संस्कृति बोतल में विस्तार सुअर का महाधमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (pSMCs) 10% (वी / वी) सुअर का सीरम (पीएस), 10% (वी / वी के साथ पूरक ) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% (वी / वी) पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन-स्ट्रेप)।
- ≈90% संगम पर से संस्कृति के माध्यम से निकाल कर pSMCs (बीतने 2-4) को अलगpSMCs की कुप्पी, trypsin समाधान के 5 मिलीलीटर (फॉस्फेट बफर नमकीन घोल में 1x, पीबीएस) जोड़ने, और 10 मिनट (टी = 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 100% आर्द्रता) के लिए incubating।
- पूरी संस्कृति के माध्यम में 4 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में pSMCs Resuspend।
- पहले 10 में वर्णित के रूप में कोलेजन समाधान तैयार है।
- निकालें और एक पीबीएस समाधान में चूहे-पूंछ tendons से कोलेजन बंडलों इकट्ठा।
- एसीटोन (5 मिनट), isopropanol के 70% (वी / वी) (5 मिनट) और एसिटिक एसिड में बाद में कोलेजन तंतुओं स्थानांतरण (0.02 एन, 48 घंटा, 4 डिग्री सेल्सियस) समाधान।
- 3 दिन के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर चिपचिपा समाधान और फ्रीज ब्लेंड।
- कोलेजन स्पंज प्राप्त करने के लिए जमे हुए समाधान Lyophilize।
- 45 मिनट के लिए 29,581 छ बल पर 4 जी / एल और सेंट्रीफ्यूज की एकाग्रता में एसिटिक एसिड समाधान (0.02 एन) में कोलेजन स्पंज solubilize।
- बाद में एस के खिलाफ डायलिसिस प्रक्रिया के माध्यम से कोलेजन समाधान जीवाणुरहितएसिटिक एसिड के olutions (0.02 एन, 1 घंटा), क्लोरोफॉर्म 1% (वी / वी, 1 घंटा) और एसिटिक एसिड (0.02 एन, बाँझ समाधान 1 सप्ताह के लिए हर 2 दिन बदल)।
- एक बाँझ सेल संस्कृति हुड में बाँझ कोलेजन समाधान (4 जी / एल) ले लीजिए।
- 3 चित्र में दिखाया के रूप में cellularized कोलेजन जैल तैयार करें।
- बाँझ विआयनीकृत पानी की 8 मिलीलीटर में DMEM के 35 मिलीलीटर (5x), HEPES (1 एन) के 4 मिलीलीटर, NaOH (1 एन) के 3 मिलीलीटर के मिश्रण से बाँझ बफर समाधान के 50 मिलीलीटर तैयार करें।
- बफर समाधान और 25% (v / v) के 25% के साथ (वी / वी) बाँझ कोलेजन समाधान के (एसिटिक एसिड 0.02 एन के 4 जी / एल) 50% के मिश्रण से बर्फ में रखा एक कंटेनर में कोशिकाओं और कोलेजन जेल मिश्रण तैयार करें (वी / वी) पूरी संस्कृति के माध्यम में pSMCs के निलंबन की।
- मिश्रण के पीएच उपाय है और यह 7.0 और 7.4 के बीच है कि सुनिश्चित करते हैं।
- जैसा कि ऊपर उल्लेख आवास / मोल्ड जटिल (कदम 1.4.3, चित्रा 3 ए-बी में कोशिकाओं की और कोलेजन मिश्रण का धीरे 9 मिलीलीटर डालो
- यह सेल संस्कृति हुड (चित्रा 3 बी) के तहत 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर जेल करते हैं।
- स्टेटिक bioreactor में परिपक्वता
- संस्कृति के माध्यम से (चित्रा 3 डी) के 35 मिलीग्राम से युक्त, मोल्ड (चित्रा -3 सी) को हटाने और जलाशय में ध्यान से निर्माण हस्तांतरण।
- स्थिर परिपक्वता की 1 या 2 सप्ताह के लिए ऊर्ध्वाधर स्थिति में निर्माण (टी = 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 100% आर्द्रता) सेते हैं।
- निर्माण के सामने इनक्यूबेटर अंदर (इन्सुलेशन सुनिश्चित करने के क्रम में सील) एक वेब कैमरा स्थापित करें।
- Luer पट बंदरगाह से पुराने मध्यम aspirating और ताजा संस्कृति के माध्यम से एक बराबर राशि के साथ जलाशय को फिर से भरने के द्वारा हर 2 दिन संस्कृति के माध्यम से बदलें।
- एसएमसी-कोलेजन की मोटाई और चयापचय क्रिया का मापन स्टेटिक संस्कृति के दौरान Constructs जेल आधारित
- सेल cultu में स्कैनिंग लेजर interferometer रखेंहुड कर रहे हैं और एक आत्मा के स्तर का उपयोग कर क्षैतिज स्थिति के लिए ऊर्ध्वाधर से यह फ्लिप।
- सेल संस्कृति हुड में बायोरिएक्टर स्थानांतरण और जलाशय से निर्माण को हटा दें।
- लेजर बीम के मार्ग में निर्माण (अब भी खराद का धुरा पर घुड़सवार) हस्तांतरण, और (4 चित्र में दिखाया गया है) बीम अक्ष के लिए सम्मान के साथ सख्ती से orthogonally जगह है।
- निर्माण के बाहरी व्यास करने के लिए इसी स्कैनिंग लेजर interferometer की स्क्रीन पर प्रदर्शित मूल्य, पढ़ें।
- उसके बाहरी और आंतरिक व्यास पर (खराद का धुरा व्यास यानी) आधारित निर्माण की दीवार मोटाई की गणना।
नोट: पहले 12 घंटा और फिर हर 24 घंटे के लिए हर घंटे 2.3.5 के लिए कदम 2.3.1 दोहराएँ। - रक्त गैस विश्लेषक के साथ लैक्टेट और ग्लूकोज सांद्रता को मापने के लिए (मध्यम संस्कृति, कदम 2.2.4 बदल रहा है जब नमूना) पुरानी संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर का प्रयोग करें।
- के 1 मिलीलीटर का प्रयोग करेंग्लूकोज और लैक्टेट सांद्रता माप 14 के लिए एक आधारभूत स्तर के रूप में ताजा संस्कृति के माध्यम से।
नोट: चरणों 2.3.6 और संस्कृति के माध्यम से बदलने के बाद 2.3.7 हर 2 दिन दोहराएँ।
- इसके अलावा यांत्रिक और जैविक Ccharacterizations के लिए फसल काटने का निर्माण
- स्थिर परिपक्वता अवधि की 1 या 2 सप्ताह के बाद, सेल संस्कृति हुड में स्थिर बायोरिएक्टर हस्तांतरण।
- ताजा संस्कृति के माध्यम से 40 एमएल (चित्रा 5 और चित्रा 7A) युक्त एक 100 मिमी व्यास पेट्री डिश के लिए धीरे अपने खराद का धुरा (पूरक वीडियो 1) से परिपक्व निर्माण स्थानांतरण।
अनुदैर्ध्य और परिधीय दिशा में constructs के 3. यांत्रिक विशेषता
- नमूनों को एक रखने के लिए एक 5 या 10 एन लोड सेल और 37 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस युक्त एक स्नान के साथ सुसज्जित micromechanical परीक्षक से मिलकर प्रयोगात्मक सेट अप स्थापित करेंटी छद्म शारीरिक स्थितियों (चित्रा 6)।
- लोड सेल और एक्सटेन्सोमीटर बैलेंस।
नोट: संतुलन प्रदर्शित विस्तार मूल्य और कोई नमूना मशीन पर मुहिम शुरू की है, जबकि प्रदर्शित लोड मूल्य रीसेट करने में मिलकर micromechanical परीक्षक में एकीकृत एक समारोह है। इस समारोह में दोनों माप के लिए संदर्भ में परिभाषित करने की अनुमति देता है। - मैकेनिकल तंत्र पर ट्यूबलर निर्माणों बढ़ते: अनुदैर्ध्य दिशा।
नोट: सीधे पूरे ट्यूबलर निर्माणों पर अनुदैर्ध्य थकान परीक्षण प्रदर्शन। लोड सेल करने के लिए और पीबीएस स्नान के आधार करने के निर्माणों की धुंध पकड़ती कनेक्ट करने के लिए घर में निर्मित उत्साहित उपकरणों का उपयोग करें।- ट्यूबलर कटाई प्रक्रिया (धारा 2.4) निम्नलिखित उत्साहित उपकरणों (चित्रा 7B), पर निर्माण माउंट।
- परीक्षण के दौरान किसी भी धुंध पकड़ती के फिसल को रोकने के लिए Teflon टेप के साथ एक साथ मनोरंजक उपकरणों और धुंध पकड़ती लपेटें।Micromechanical परीक्षक (चित्रा 7C) पर नमूना माउंट।
- मैकेनिकल तंत्र पर अंगूठी के आकार निर्माणों बढ़ते: परिधीय दिशा।
नोट: ट्यूबलर निर्माणों से sectioned अंगूठी के आकार के नमूनों पर परिधीय थकान परीक्षण प्रदर्शन। नमूनों धारण करने के लिए पकड़ती के रूप में दो स्टेनलेस स्टील बार्स का प्रयोग करें।- एक समर्थन कटाई (धारा 2.4) निम्नलिखित 5 मिमी अंतराल (चित्रा 7B), के साथ चिह्नित के रूप में ट्यूबलर एक प्लास्टिक पाइप पर निर्माण माउंट।
- ट्यूबलर निर्माण से 10 मिमी के छल्ले काटें।
- आगे के विश्लेषण के लिए एक vernier कैलिपर का उपयोग कर नमूना की लंबाई को मापने।
- Micromechanical परीक्षक (चित्रा 7C) के स्टेनलेस स्टील बार्स पर अंगूठी के आकार का नमूना माउंट। सलाखों के केंद्र में नमूना स्थान के लिए सुनिश्चित करें।
नोट: प्लास्टिक पाइप कदम 3.4.1 और एक काटने प्रणाली में चित्रा 7B के रूप में दिखाया
- अनुदैर्ध्य या परिधीय दिशा में निर्माणों पर थकान परीक्षण।
- अपनी प्रारंभिक गेज लंबाई तक का निर्माण स्ट्रेच।
- छद्म मनोवैज्ञानिक वातावरण में 10 मिनट के लिए इस स्थिति में निर्माण को बनाए रखें।
- 5% / सेक तनाव दर पर निर्माण करने के लिए प्रारंभिक गेज लंबाई (30 चक्रों) का 10% चक्रीय तनाव को लागू करें।
- नमूने की विफलता तक 10% चक्रीय तनाव के वृद्धिशील कदम पर कदम दोहराएँ 3.5.3।
नोट: छद्म मनोवैज्ञानिक वातावरण के उपयोग के खाते में उछाल और लागू लोड की माप को प्रभावित करने वाले मनोरंजक प्रणाली की जड़ता लेने की आवश्यकता है। - इस प्रकार के रूप पृष्ठभूमि रिकॉर्ड
- प्रारंभिक गेज लंबाई करने के लिए भार फ्रेम ले जाएँ।
- किसी भी नमूने घुड़सवार बिना चरणों 3.5.3 और 3.5.4 दोहराएँ, और लोड सेल से जुड़ा उत्साहित उपकरणों रखने (केवल 1 चक्र requi हैलाल)।
Constructs के 4. Luminal Endothelialization
नोट: कटाई प्रोटोकॉल (धारा 2.4) निम्नलिखित के बाद, निर्माणों आगे endothelialization के लिए घूर्णन दीवार बायोरिएक्टर में रखा जा करने के लिए से निपटने का सामना।
- घूर्णन दीवार Bioreactor डिजाइन
- Aerating छेद को शामिल किया गया है कि फिल्टर झिल्ली को नुकसान पहुँचाए बिना जलाशय ट्यूब के हवादार टोपी के केंद्र में एक 4.5 मिमी व्यास छेद ड्रिल।
- छेद में एक खराद का धुरा (व्यास = 4.5 मिमी, लंबाई = 40 मिमी) प्रेस फिट और कदम 1.1.2 में वर्णित के रूप में खराद का धुरा ठीक।
- निर्माण बाहरी व्यास के लिए दो सी के आकार सिलिकॉन समर्थन को तैयार = 14 मिमी; आंतरिक व्यास = 8 मिमी)।
- घूर्णन दीवार बायोरिएक्टर के एक छोर में एक घूर्णन मोटर और दूसरे छोर (चित्रा 8B) पर असर स्थिति।
- लुमेन Endothelialization
- मानव umbilic का विस्तार करेंअल 10% (वी / वी) पी एस, 10% के साथ पूरक M199 संस्कृति के माध्यम से 5 मिलीलीटर के साथ 25 सेमी 2 संस्कृति बोतल में endothelial कोशिकाओं (HUVECs) नस (वी / वी) FBS, 1% (वी / वी) कलम-स्ट्रेप 90% संगम तक एक मशीन (टी = 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 100% आर्द्रता) के अंदर पेट्री डिश में।
- सीरम मुक्त endothelial सेल संस्कृति माध्यम में 10.5 एनजी / एमएल के लिए ध्यान केंद्रित प्रोटीन मिश्रण गिराए द्वारा इष्टतम कोशिका आसंजन के लिए आवश्यक निर्माण प्रति प्रोटीन कोटिंग समाधान के 1.5 एमएल तैयार करें।
- एक vernier कैलिपर का उपयोग करते हुए निर्माण की लंबाई को मापने।
- Luminal मात्रा वी और निर्माण के luminal क्षेत्र एक गणना के रूप में: वी = क्रमशः डी एल में 2 एल / 4 और ए = डी में (डी खराद का धुरा व्यास करने के लिए इसी भीतरी व्यास है जहां, और एल निर्माण की लंबाई है)।
- कटाई प्रक्रिया (धारा 2.4) निम्नलिखित जलाशय के केंद्र में निर्माण की स्थिति।दोनों जलाशय (चित्रा 8A) के लिए समाप्त हो जाती है पर निर्माण ठीक करने के लिए सी के आकार सिलिकॉन समर्थन का प्रयोग करें।
- संस्कृति के माध्यम से 35 मिलीलीटर के साथ जलाशय भरें।
- कदम 4.2.2 में तैयार प्रोटीन कोटिंग समाधान के साथ निर्माण (वी) की गणना की luminal मात्रा का 75% भरें। प्रोटीन कोटिंग समाधान (चित्रा 8A) के किसी भी रिसाव से बचने के लिए निर्माण के हाथ पैरों के दोनों बंद करें।
- सेल संस्कृति हुड के अंदर घूर्णन दीवार बायोरिएक्टर प्रणाली को इकट्ठा।
- एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बायोरिएक्टर प्लेस और चित्रा 8B रूप में दिखाया गया luminal कोटिंग अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए 4.02 एक्स 10 -5 जी बल पर बायोरिएक्टर के रोटेशन शुरू करते हैं।
- निर्माण के ऊपरी सिरा खोलें और लुमेन से प्रोटीन कोटिंग समाधान aspirate।
- HUVECs की कुप्पी से संस्कृति के माध्यम से दूर करने और trypsin समाधान के 3 मिलीग्राम (पीबीएस में 1x) जोड़कर HUVECs (बीतने 2-3) को अलग करें। मैं5 मिनट (टी = 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 100% आर्द्रता) के लिए ncubate।
- पूरक M199 संस्कृति के माध्यम में 4 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में HUVECs Resuspend।
- सेल संस्कृति हुड के अंदर,। 1,000 कोशिकाओं / 2 सेमी 15 के घनत्व के साथ निर्माण के लुमेन में HUVECs बीज HUVECs समाधान के किसी भी रिसाव से बचने के लिए निर्माण के ऊपरी extremities बंद करें।
- 4.02 एक्स 10 -5 जी बल के एक निरंतर रोटेशन में 2 दिनों के लिए घूर्णन दीवार बायोरिएक्टर (चित्रा 8B) और संस्कृति में निर्माणों (टी = 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 100% आर्द्रता) की मेजबानी की सेते हैं।
- बाँझ परिस्थितियों में संस्कृति के 2 दिनों के बाद निर्माण हार्वेस्ट और धारा 2.4 में वर्णित के रूप में आगे जैविक लक्षण वर्णन के लिए यह तैयार करते हैं।
Representative Results
इस काम नाड़ी कोशिकाओं से युक्त इंजीनियर ट्यूबलर कोलेजन आधारित निर्माणों के निर्माण का वर्णन है। पहले से ही जल्दी जमाना के 1 घंटे के बाद, कोशिकाओं की और कोलेजन मिश्रण सीधे (14 मिमी के आसपास) इसी मोल्ड के व्यास के बराबर बाहरी व्यास के साथ एक 3 डी ट्यूबलर ज्यामिति में इकट्ठा किया गया था। सभी स्थिर परिपक्वता के साथ, माप तालिका 1 में दिखाया गया है।, स्थिर संस्कृति के 1 दिन के बाद अपनी प्रारंभिक मूल्य के बारे में 60% की सिकुड़ cellularized कोलेजन जैल के व्यास ट्यूबलर cellularized संरचनाओं के बाहरी व्यास का तेजी से कमी का पता चला है, और 7 दिन (पूरक वीडियो 2) के भीतर का लगभग 85%। इस घटना गैर cellularized कोलेजन scaffolds में घटित नहीं करता है के रूप में निर्माणों के भीतर एसएमसी, सिकुड़ते मनाया और संबंधित यांत्रिक सुदृढीकरण के लिए जिम्मेदार हैं। किसी भी प्रकार के (थर्मल, जैव रासायनिक, यांत्रिक, या अन्य) का कोई ढाल लागू किया गया था कि ध्यान दें। कोशिकाओं ड्राइवएन संघनन संभाला और यांत्रिक अनुरोध को वश में किया जा सकता है कि अधिक से अधिक कोलेजन घनत्व के साथ एक सामग्री के परिणामस्वरूप (पूरक वीडियो 3 और 4)।
समग्र यांत्रिक और viscoelastic गुण कोशिकाओं संचालित remodeling के संबंधित करने के लिए, थकान परीक्षण निर्माणों (पूरक वीडियो 5 और 6) पर प्रदर्शन किया गया। इन परीक्षणों के विभिन्न निरंतर उपभेदों में निर्माणों (30 बार) (10%, 20%, और प्रारंभिक गेज लंबाई की 30%) साइकिल और समय के साथ यांत्रिक याचना करने के लिए निर्माणों की प्रतिक्रिया के रूप में तनाव रिकॉर्ड करने के लिए में शामिल थे। एक का निर्माण के लिए प्रतिनिधि परिणाम 9 चित्रा में दिखाए जाते हैं। निर्माण एक ही तनाव रेंज (30% तनाव) के अधीन जब परिधीय दिशा (16 किलो पास्कल) की तुलना में अनुदैर्ध्य दिशा (75 किलो पास्कल) में उच्च तनाव झेल। इस बीच, प्रत्येक चक्र में, तनाव चरम मूल्य प्रादेशिक सेना के लिए पहुँचेrgeted अधिकतम तनाव समय के साथ कम किया है। यह व्यवहार इन कोलेजन आधारित निर्माणों द्वारा प्रदर्शित उच्च viscoelastic गुण की खासियत है।
cellularized निर्माणों की जैविक गतिविधि स्थिर परिपक्वता के दौरान मूल्यांकन किया गया था। इसलिए, एसएमसी की चयापचय क्रिया स्थिर संस्कृति के दौरान ग्लूकोज की खपत और लैक्टेट उत्पादन को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया गया था। संस्कृति के माध्यम से हर 2 दिन और ग्लूकोज नमूना था और लैक्टेट सांद्रता एक रक्त गैस विश्लेषक का उपयोग मापा गया। ग्लूकोज की खपत और निर्माणों की महत्वपूर्ण सिकुड़ने के लिए संयुक्त लैक्टेट उत्पादन में लगातार वृद्धि हुई है, सभी स्थैतिक संस्कृति (चित्रा 10) के साथ एसएमसी गतिविधि attest।
कारण सेल संचालित remodeling के लिए वृद्धि की यांत्रिक स्थिरता निर्माणों के हेरफेर और बाद endothelialization प्रक्रिया की अनुमति दी। मैसन का Trichrome धुंधला endothelialized निर्माणों पर प्रदर्शनएक अत्यधिक समरूप अन्तःचूचुक दिखाया। एसएमसी एक धुरी की तरह आकार आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया और HUVECs अच्छी तरह से luminal पक्ष (11 चित्रा) में फैला हुआ दिखाई दिया, जबकि homogenously, दीवार के माध्यम से छितरी हुई दिखाई दिया।
चित्रा 1:। स्थिर बायोरिएक्टर के घटक स्थिर बायोरिएक्टर एक संशोधित 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब (ए) और एक खराद का धुरा सुसज्जित टोपी (बी) शामिल थे। ट्यूब मध्यम जलाशय के रूप में सेवा की है, और मध्यम नमूना और बदलने के लिए, गैस आदान प्रदान के लिए 0.22 माइक्रोन फिल्टर के लिए एक बंदरगाह, और एक पट से सुसज्जित किया गया। हवादार टोपी में एक खराद का धुरा उपस्थित ट्यूबलर आकार में निर्माणों के निर्माण की अनुमति दी। धुंध पकड़ती (सी) बनाया गया है और खराद का धुरा अधिक निर्माणों का जमाना समर्थन करने के लिए गढ़े गए थे। इसके अलावा, इनपकड़ती निर्माणों स्थिर परिपक्वता के बाद संभाला करने और यांत्रिक उपकरण के लिए तय किए जाने की अनुमति दी। खराद का धुरा के बाहरी व्यास 4.7 मिमी था।
चित्रा 2: स्थिर बायोरिएक्टर के संयोजन नसबंदी से पहले बायोरिएक्टर के चरणों कोडांतरण।। धुंध पकड़ती एक निश्चित दूरी पर खराद का धुरा (ए) पर बढ़ रहे थे। एक ढालना डाला (बी) और कसकर सिलिकॉन डाट (सी) के लिए तय की गई थी। खराद का धुरा के बाहरी व्यास 4.7 मिमी था।
चित्रा 3:। बाँझ परिस्थितियों में निर्माणों का निर्माण कोशिकाओं और कोलेजन मिश्रण आवास मोल्ड जटिल में डाल दिया गया था (ए), और कमरे के तापमान (बी) पर 1 घंटे के लिए जेल जाने। बाद में, मोल्ड (सी) हटा दिया गया था, स्थिर बायोरिएक्टर (डी) को इकट्ठा किया और इनक्यूबेटर में निर्माण के स्थिर परिपक्वता (टी = 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 100% आर्द्रता) के लिए एक जलाशय के अंदर स्थानांतरित किया गया था। खराद का धुरा के बाहरी व्यास 4.7 मिमी था।
चित्रा 4:। निर्माणों की मोटाई / बाहरी व्यास का माप एक लेजर स्कैनिंग interferometer निर्माणों के बाहरी व्यास की माप प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। निर्माण लेजर बीम के मार्ग में रखा जाता है और एक छाया उत्पन्न किया गया। निर्माण के बाहरी व्यास करने के लिए इसी छाया की चौड़ाई, तो मापा जाता है और स्क्रीन पर प्रदर्शित किया गया था।
चित्रा 5:। काटा निर्माण के morphological उपस्थिति (ए) को राइट 2 सप्ताह के लिए स्थिर परिपक्वता के दौरान कोशिकाओं संचालित remodeling के बाद जमाना और (बी) के बाद।
चित्रा 6: यांत्रिक अभिलक्षण के लिए प्रयोगात्मक सेट अप यह एक 5 या 10 एन लोड सेल और छद्म शारीरिक स्थितियों में नमूने रखने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस युक्त एक स्नान के साथ सुसज्जित micromechanical परीक्षक शामिल थे।।
चित्रा 7: नमूना तैयार च या यांत्रिक अभिलक्षण। नमूना कटाई (ए) और तैयारी (बी) थकान अनुदैर्ध्य में प्रदर्शन परीक्षण और परिधीय दिशाओं (सी) के लिए। खराद का धुरा के बाहरी व्यास 4.7 मिमी था।
चित्रा 8: घूर्णन दीवार बायोरिएक्टर (ए) ट्यूबलर निर्माणों सी के आकार सिलिकॉन समर्थन की मदद से जलाशय के केंद्र में इकट्ठे हुए थे।। निर्माण के हाथ पैरों के दोनों HUVECs समाधान के किसी भी रिसाव से बचने के लिए बंद कर दिया गया। (बी) निर्माणों इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत थे (टी = 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 100% आर्द्रता) 2 दिनों के लिए 4.02 एक्स 10 -5 जी बल पर रोटेशन में।
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चित्रा 9:।। यांत्रिक अभिलक्षण अनुदैर्ध्य (ए) में निर्माणों पर प्रदर्शन थकान परीक्षण और सेल संचालित remodeling के बाद परिधीय (बी) के दिशा-निर्देशों का परिणाम यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 10:। कोलेजन जैल के भीतर एसएमसी की चयापचय क्रिया में ग्लूकोज की खपत की दर और लैक्टेट उत्पादन दर की माप संस्कृति के माध्यम से बदलने के बाद, हर 2 दिनों के रक्त गैस विश्लेषक के साथ प्रदर्शन किया गया। ताजा संस्कृति के माध्यम ग्लूकोज और लैक्टेट सांद्रता मापन के लिए एक आधारभूत स्तर के रूप में इस्तेमाल किया गया था।
चित्रा 11: लुमेन endothelialization ट्यूबलर निर्माणों के रेडियल पार वर्गों के histological छवियों।। ट्यूबलर निर्माणों की मैसन का Trichome धुंधला 1 सप्ताह (ए) और 2 सप्ताह (बी) के लिए स्थिर रुप से संवर्धित किया। एक ट्यूबलर निर्माण (सी) के एच एंड ई धुंधला हो जाना।
| समय | मोटाई (मिमी) | संघनन (%) |
| 0 घंटा | 4.83 ± 0.02 | 0 ± 0 |
| 2 घंटा | 4.26 ± 0.02 | 12 ± 0 |
| 4 घंटा | 4.21 ± 0.03 | 13 ± 1 |
| 6 घंटा | 4.06 ± 0.10 | 16 ± 2 |
| 12 घंटेआर | 3.16 ± 0.07 | 35 ± 1 |
| एक दिन | 2.08 ± 0.11 | 57 ± 2 |
| 1 सप्ताह | 0.68 ± 0.07 | 86 ± 1 |
| 2 सप्ताह | 0.36 ± 0.00 | 93 ± 0 |
तालिका 1: स्थिर परिपक्वता के दौरान निर्माण व्यास की रैपिड संघनन निर्माणों की दीवार मोटाई और स्थिर संस्कृति के समय के एक समारोह के रूप में संघनन दर।। संघनन एक स्कैनिंग लेजर interferometer (सीरीज 183B, LaserMike 136) के साथ ट्यूबलर निर्माणों के बाहरी व्यास का निर्धारण द्वारा मापा गया था। 24 घंटे के बाद, निर्माणों 57% करने के लिए उनके ढाला आयामों के ± 2% जमा हुआ। डाटा व्यक्त कर रहे हैं के रूप में मतलब ± एसडी (एन = 3)। उपस्थिति और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में रहने वाले की गतिविधि ऐसे बड़े बदलाव के लिए ही जिम्मेदार था।
रpplemental वीडियो 1:। गैर remodeled ट्यूबलर कोलेजन जैल की कटाई इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक वीडियो 2:। ट्यूबलर कोलेजन जैल की कोशिकाओं संचालित संघनन इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक वीडियो 3:। गैर remodeled ट्यूबलर कोलेजन जैल के हेरफेर इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक वीडियो 4:। कोशिकाओं-remodeled ट्यूबलर कोलेजन जैल के हेरफेर वें देखने के लिए यहां क्लिक करेंवीडियो है।
पूरक वीडियो 5:। अनुदैर्ध्य थकान परीक्षण (30%) में कोशिकाओं-remodeled ट्यूबलर कोलेजन जैल पर इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक वीडियो 6:। परिधीय थकान परीक्षण (30%) में कोशिकाओं-remodeled ट्यूबलर कोलेजन जैल पर इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
संवहनी ऊतक इंजीनियरों के समुदाय के बीच जबरदस्त प्रयासों रक्त वाहिकाओं 16 के यांत्रिक स्थिरता के लिए जिम्मेदार Tunica मीडिया परत को पुन: पेश करने के लिए किया गया है। वेनबर्ग और बेल 17 के अग्रणी काम के बाद से, कोलेजन व्यापक रूप से है क्योंकि इसकी biocompatibility, गैर immunogenic गुण और उपलब्धता की संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक पाड़ के रूप में इस्तेमाल किया गया है। इस सामग्री के कारण यांत्रिक कठोरता के आंतरिक कमी के कारण, संभाल करने के लिए आसान नहीं है लेकिन, जैसा कि कोलेजन का उपयोग करते हैं, शोधकर्ताओं के लिए एक बड़ी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। पाड़ की तैयारी के दौरान जोड़तोड़ आगे उपयोग के लिए उन्हें कोई समझौता किए, मचान नुकसान हो सकता है।
इस काम में वर्णित तकनीक की अनुमति देता है: मैं) एक ट्यूबलर के आकार का ज्यामिति में cellularized कोलेजन जैल करने के लिए इंजीनियर, द्वितीय) एक छोटी स्थिर परिपक्वता अवधि (1 या 2 सप्ताह) के बाद से संभाला जा करने के लिए पर्याप्त मजबूत जैविक ऊतकों करने के लिए इंजीनियर, iii) के रूप में करने के लिए2 दिशाओं में ऐसे ट्यूबलर के आकार का जैविक ऊतकों की सेक्स यांत्रिक और viscoelastic गुण। जेल में कोशिकाओं कोलेजन मैट्रिक्स remodeling में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। परिपक्वता अवधि के दौरान, सिकुड़ा एसएमसी अनुदैर्ध्य और परिधीय दिशाओं में मूल्यांकन किया जा सकता है कि उच्च यांत्रिक स्थिरता के साथ एक निर्माण से बेदखल जैल के संघनन के लिए नेतृत्व किया। निर्माणों इस प्रकार संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए कोलेजन जैल की उपयुक्तता का प्रदर्शन, एक समरूप और व्यवहार्य अन्तःचूचुक उत्पन्न की बाद में, HUVECs luminal पक्ष में वरीयता प्राप्त।
इस काम में प्रस्तुत बायोरिएक्टर विशेष रूप से स्थिर परिपक्वता के दौरान सेल के विकास के लिए एक इष्टतम वातावरण प्रदान करने के लिए डिजाइन किया गया था। इसके अलावा, निर्माणों के यांत्रिक और viscoelastic गुण के लक्षण वर्णन के लिए विकसित उपकरणों के हेरफेर के लिए निहित किसी भी संभावित नुकसान को कम करने के उद्देश्य के साथ डिजाइन किए गए थेऐसे नाजुक सामग्री। इसलिए, स्थिर बायोरिएक्टर टोपी पर 0.22 माइक्रोन फिल्टर और एक फिल्टर झिल्ली (कदम 1.1.2, चित्रा 1 ए का सुसज्जित किया गया और बी) एक बाँझ संस्कृति वातावरण रखते हुए, जलाशय और इनक्यूबेटर अंदर संस्कृति के माध्यम के बीच गैस विनिमय की अनुमति दी। तल पर luer पट संस्कृति के माध्यम से नमूना लेने के लिए एक बंदरगाह के रूप में इस्तेमाल किया और स्थिर संस्कृति के दौरान बदल रहा था। कुछ महत्वपूर्ण कदम के निर्माण के निर्माण और अभिलक्षण के दौरान विचार किया जाना है। प्रणाली के बाँझपन को बदल सकता है कि (बाद के चरणों कदम 2.1.1 में और में प्रदर्शन) सभी जोड़तोड़ एक बाँझ जैविक हुड में प्रदर्शन किया गया। सेल और कोलेजन जेल मिश्रण तैयारी जमाना प्रक्रिया में देरी करने के क्रम में बर्फ पर संभाला था (2.1.7 के लिए 2.1.4 कदम)। कदम 2.1.7 में, पूर्व जमाना करने के लिए मिश्रण में फँस किसी भी हवाई बुलबुले के समझौता कर सकते हैं कि संभावित तनाव एकाग्रता क्षेत्रों रहे हैंनिर्माणों की tability। इसलिए, इस तरह हवा के बुलबुले के हटाने से थोड़ा विधानसभा मिलाते हुए या बाँझ परिस्थितियों में degasing के लिए 3 मिनट के लिए चिकित्सा निर्वात का उपयोग करने की आवश्यकता है। अंत में, विशेष रूप से पकड़ती है जमाना दौरान ट्यूबलर सांचे में केंद्रीय खराद का धुरा की धुरी को बनाए रखने के लिए और endothelialization के लिए, (खराद का धुरा के हटाने, धारा 2.4) कटाई के दौरान निर्माणों की नाजुक हेरफेर की अनुमति के लिए तैयार है, और सुविधाजनक बनाने पर बढ़ते के लिए गया यांत्रिक प्रणाली (अनुदैर्ध्य परीक्षण)।
वर्तमान प्रोटोकॉल एसएमसी की प्राकृतिक निहित सिकुड़ा क्षमता के आधार पर कोलेजन जैल निर्माणों के सुदृढीकरण के एक मूल आसान करने के लिए प्रक्रिया वैकल्पिक दृष्टिकोण का प्रस्ताव है। - 20 कोलेजन matrices के सुदृढीकरण के आम तकनीकों कोशिकाओं-मैट्रिक्स बातचीत 18 पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है कि भौतिक और रासायनिक crosslinking एजेंट के इस्तेमाल को शामिल। में प्रस्तुत निर्माण तकनीकइस काम को कोई शारीरिक या रासायनिक उपचार के बिना लक्षित यांत्रिक गुणों के साथ एक ऊतक इंजीनियर निर्माण उपज के लिए यह कोशिकाओं संचालित remodeling प्रक्रिया निर्देशन की अनुमति देता है।
हाइड्रेटेड कोलेजन जैल के यांत्रिक और viscoelastic गुण की विशेषता एक बड़ी चुनौती है। इस परिप्रेक्ष्य में, वर्तमान प्रोटोकॉल ट्यूबलर नरम ऊतकों के यांत्रिक गुणों का आकलन करने के लिए एक मूल सरल और कारगर तरीका वर्णन करता है। यह लक्षण वर्णन सीधे पूरे ट्यूबलर संरचना पर, परिधीय दिशा में, लेकिन यह भी अनुदैर्ध्य दिशा में न केवल प्रदर्शन किया जा सकता है। यांत्रिक लक्षण, तापमान, जलीय पर्यावरण, पीएच और आयनिक ताकत के दौरान काफी जैविक ऊतकों 21 के यांत्रिक व्यवहार को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है कि पर्यावरणीय कारकों में से कुछ हैं। इसलिए, वर्तमान कार्य एक अत्यधिक में जैविक ऊतकों के यांत्रिक लक्षण वर्णन के लिए एक मूल सेट अप और प्रोटोकॉल पता चलता हैप्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य छद्म मनोवैज्ञानिक वातावरण (37 डिग्री सेल्सियस और 7.4 पीएच पर नमकीन घोल)। हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, लक्षण के इस तरह के अन्य जगहों पर सूचित कर दिया गया कभी नहीं किया है।
अंत में, इस काम में प्रस्तावित तकनीक संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए कोलेजन के साथ कोशिकाओं के प्रत्यक्ष मिश्रण की उच्च क्षमता को दर्शाता है। यांत्रिक लक्षण वर्णन और endothelialization प्रक्रिया के साथ मिलकर इस विधि उच्च polyvalent प्रोटोकॉल का गठन। इसलिए, सेट-अप और एक ही औचित्य रखते हुए प्रोटोकॉल के मामूली संशोधनों के माध्यम से, इंजीनियरिंग संवहनी ऊतक समकक्ष के लिए मुख्य आवश्यकताओं तेजी से और सीधी endothelialization सहित प्रसंस्करण, और संभावना के रूप में इस तरह संबोधित किया जा सकता मुलायम की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए स्थानांतरित किया जाना है विभिन्न लंबाई और व्यास के साथ ऊतकों। इसके अलावा, पक्षपाती सेल प्रकार, ईसीएम प्रोटीन और ढाला geometries के विभिन्न लक्षित अनुप्रयोगों के एक नंबर के लिए जांच की जा सकती हैइस तरह के अन्य लोगों के अलावा इंजीनियरिंग, tendons, त्वचा grafts, हृदय पैच, नसों, के रूप में ऑन,। निर्माणों के यांत्रिक गुणों को प्रोत्साहित कर रहे हैं, वे देशी ऊतकों की तुलना में अभी भी कम हैं। इस संदर्भ में, हम दृढ़ता से एक बहुत ही कम स्थिर परिपक्वता अवधि इस प्रकार एक उच्च संरचनात्मक अखंडता और यांत्रिक स्थिरता के लिए अग्रणी, एक बायोरिएक्टर में गतिशील उत्तेजना की ओर एक महत्वपूर्ण कदम है कि विश्वास करते हैं। हालांकि, संभावना तेजी से यांत्रिक के लिए उपयुक्त ऊतक इंजीनियर cellularized कोलेजन आधारित निर्माणों का उत्पादन करने के लिए और ऊतकीय विकास और remodeling, या भी करने के दौरान कोशिकाओं और ईसीएम के बीच परस्पर क्रिया में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए एक उपयोगी और होनहार उपकरण के साथ साथ वर्णित स्थिर बायोरिएक्टर बनाता विश्लेषण चिकित्सा और दवा वितरण प्रणाली के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा।
Disclosures
कोई धन हितों के संभावित संघर्ष के साथ संगठनों या एजेंसियों से प्राप्त किया गया था।
Acknowledgments
इस शोध प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद, स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए कनाडा संस्थान और चू डी क्यूबेक अनुसंधान केंद्र द्वारा वित्त पोषित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTreat 50 ml Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
| Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
| Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
| Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | - | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
| Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
| Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
| Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
| Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
| Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | - | C-shaped silicone support for endothelialization |
| Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
| Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
| Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
| 0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%) | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
| Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
| Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
| NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
| LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
| ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | - | Micromechanical Tester |
| HyClone Media M199/EBSS, 500 ml | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
| Fetal bovine serum HI - 500 ml | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
| Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
| Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
| Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
| ColorpHast- pH-indicator strips (pH = 6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml vial | BD Biosciences - Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
| LifeCam VX-3000 | Microsoft | - | Thickness measurement |
| Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | - | Glucose and lactate concentrations measurements |
| Collagen fibers | Rat tails | - | Collagen was extracted in the laboratory |
| Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | - | pSMCs were isolated in the laboratory |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | - | HUVECs were isolated in the laboratory |
References
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