Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici
Summary
We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.
Abstract
Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.
Introduction
Atomic Force Microscopy (AFM) genera un'immagine di una superficie di scansione attraverso l'area del campione utilizzando una mensola con una punta molto affilata 1. Il movimento del cantilever sonda la topologia superficiale del campione. AFM è stato ampiamente applicato alle molecole biologiche – come proteine, DNA e membrane, grazie alla sua versatilità nell'analisi campioni fissati in aria o stato quasi native nel liquido 2-5.
Oltre alla sua capacità di imaging ad alta risoluzione in nanometri, il cantilever AFM agisce come una molla per sondare forze di interazione (adesione e repulsione) e le proprietà meccaniche del campione di 5,6. Questo è noto come spettroscopia di forza. In questa modalità, la prima sonda si avvicina al campione e esercita una forza su di esso, allora viene retratto fino perde contatto con il campione (Figura 1A). Le curve generate mostrano forza in funzione della distanza del cantilever sia per l'applicazionescarafaggio e retrazione. Diversi proprietà incluso il modulo elastico per misurare la rigidità di un materiale, e le forze di adesione possono essere derivati.
Bistrati lipidici supportati sono membrane biologiche modello situata sulla sommità di un supporto solido – solitamente mica, vetro borosilicato, silice fusa, o ossidato silicio 7. Sono preparati utilizzando varie tecniche come vescicole deposizione, metodo Langmuir-Blodgett e spin-coating 8,9. L'imaging AFM è stato utilizzato per seguire la formazione di questi bistrati supportati 10, e sonda diverse strutture formate da membrane di diverse composizioni 11-15.
Esecuzione di spettroscopia di forza su bistrati risultati supportati in un picco nella curva approccio. Questo picco indica la forza necessaria per perforare il doppio strato, e si chiama forza rivoluzionaria. Lo spessore doppio strato può essere misurata utilizzando la curva della forza 6. La forza innovativa tipica di bistratirange compreso tra 1-50 nN 6. Queste proprietà dipendono imballaggio lipidi (liquido o gel fase) e la struttura (acil lunghezza della catena e il grado di insaturazione) e modificata da agenti membrana attiva 16. La teoria dietro la rottura è stato spiegato il 17 ed altri parametri sperimentali come cantilever morbidezza, il raggio e la velocità di punta approccio influenzare anche la forza rivoluzionaria 15,16,18. Spettroscopia di forza è stato utilizzato per analizzare le proprietà di diverse fasi lipidiche 11,19, composizione-dipendente cambiamenti 12,20, così come gli effetti di altre biomolecole, quali peptidi, sulla stabilità della membrana 21.
L'orientamento piatta di bistrati supportati è vantaggioso per combinare AFM con altri metodi come la risonanza plasmonica superficiale 22 e microscopia a fluorescenza 11,19 per meglio caratterizzare struttura e le proprietà delle membrane.
Questo video proto dettagliatacol lo scopo di preparare i doppi strati lipidici supportati con vescicole deposizione e analizzarli con AFM e spettroscopia di forza. Mentre vescicole di varie dimensioni possono essere usati per preparare bistrati, questo protocollo si concentra sulle piccole e grandi vescicole unilamellari. Bistrati supportati quella fase separano in liquido ordinato (L o) e disordinati (L d) fasi liquide sono state caratterizzate 11,15. La membrana è composta di-oleoyl-fosfatidilcolina (DOPC), sfingomielina (SM) e colesterolo (Chol) a 2: 2: 1 ratio. Questi modelli di composizione delle zattere lipidiche, che sono proposti a comportarsi come piattaforme importanti per il traffico di proteine e di smistamento, segnalazione cellulare e altri processi cellulari 23,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
SLB composti DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) sono formati sulla mica dopo vescicole adsorbimento e rottura indotta da cloruro di calcio. Questa composizione lipidica separato in L d e L o fasi. La fase L o si arricchisce in sfingomielina e colesterolo ed è meno fluido / più viscoso (Figura 1A) che l'L d di fase 11. La separazione di L o di fase L d manifesta come strutture circolari elevata sopra la circostante (Figura 1…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Max Planck Society, il tedesco Cancer Research Center, l'Università di Tubinga, e il Bundesministerium für Bildung und Forschung (concessione n. 0.312.040).
Ringraziamo Eduard Hermann per averci aiutato ad automatizzare l'analisi dei dati curva forza e il Dr. Jakob Suckale un'attenta lettura di questo manoscritto.
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20°C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1679&Itemid=398 |
| Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
| Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
| Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
| HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Glass coverslip, 24×60 mm, 1mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
| Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
| Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
| Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
| Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
| Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
| Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
| Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf |
| Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
| AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |
Referenzen
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