We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.
Один из важнейших процессов воспаления инфильтрации иммунных клеток из просвета кровеносного сосуда на окружающие ткани. Это происходит, когда эндотелиальные клетки, которые выстилают кровеносные сосуды, становится клей циркулирующих иммунных клеток, таких как моноциты. В пробирке измерение этой адгезионной не до сих пор было сделано путем количественной оценки общего числа моноцитов, которые прилипают к эндотелиальной слоя либо в виде прямого счета или путем косвенного измерения флуоресценции прикрепленных моноцитов. В то время как такие измерения действительно указывают среднюю адгезивность эндотелиальных клеток популяции, они смешиваются с помощью ряда факторов, таких как число клеток, и не раскрывают долю эндотелиальных клеток, которые на самом деле адгезив. Здесь мы описываем и продемонстрировать метод, который позволяет перечисление адгезивных клеток в тестируемой популяции эндотелиальных монослоя. Эндотелиальные клетки выращивают на покровных стеклах и после желанииЛечение ставятся моноцитов (которые могут быть помечены флуоресцентно). После инкубации, промывки процедуры, с участием нескольких раундов погружения и слива, клетки фиксируют. Клей эндотелиальные клетки, которые окружены моноцитов легко идентифицируются и перечислены, давая индекс адгезии, который показывает фактическую долю эндотелиальных клеток в популяции, которые клей.
Проникновение иммунных клеток, таких как моноциты через эндотелиальный слой клеток, выстилающих кровеносные сосуды является важным шагом в процессе воспаления 1. Это позволяет самонаведения иммунных клеток (иммуноцитов) до места повреждения. В других случаях и местах, таких как коронарной артерии и сонной артерии, инфильтрацию моноцитов через эндотелиальный слой может привести к нежелательному долгосрочного проживания этих клеток в стенке артерии, что может привести к образованию бляшек 2. Во всех случаях иммуноцитов инфильтрации, первый этап включает в себя активацию эндотелиальных клеток в локализованной области кровеносного сосуда. Эндотелиальные клетки активируются провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α и IL-6 для увеличения экспрессии белков клеточной поверхности, таких как VCAM, ICAM и Е-селектина, которые облегчают набор и прикрепление иммуноцитов на поверхности эндотелиальных клеток 3- 6.
<p cдевушка = "jove_content"> Первоначально, измерение эндотелиальной клеточной адгезии проводили путем подсчета моноциты, которые присоединились к эндотелиальным монослой 7. Ограничения этого метода с точки зрения точности привело к использованию радиоактивно меченого лимфоцитов или моноцитов, с последующим количественным радиоактивного материала, который соответствует лимфоцитов или моноцитов адгезии 4. Этот метод был в конечном счете заменен методом флуоресцентной основе, в результате чего иммуноцитов, представляющие интерес, меченного флуоресцентной краской и подвергали той же процедуре, что и выше с той разницей, что вместо флуоресценции измеряют радиоактивность 8. В настоящее время этот метод возник как наиболее удобный и продается в разобранном виде несколькими коммерческими поставщиками. В то время как этот анализ может измерить относительные уровни адгезивности между контрольной и экспериментальных образцов, не раскрывает ли изменение в флуоресценции за счет равномерного изменения адгезионной по всей еndothelial клеточной популяции, или если изменение происходит из-за разницы адгезивности в субпопуляции клеток. Очевидно также, что строгость промывки оказывает глубокое влияние на результат, и что более важно, равномерность промывки от несвязанных моноциты между различными монослоев эндотелиальных клеток значительно повлиять на близость результатов от повторов и воспроизводимости результатов между образцами , Совсем недавно, несколько систем, которые качают моноциты в СМИ по эндотелиальных клеток монослоя были использованы для решения этой проблемы 9. Кроме того, эти системы потока и воспроизводят эффект силы сдвига на эндотелиальные клетки. Хотя преимущества таких систем являются четкими и очень привлекательным, важно также понимать, что в то время как эндотелиальные клетки адгезивность может быть значительно увеличена, так как это имеет место при остром воспалении, такие факторы, как ФНО, некоторых других активаторов, таких как ионизирующее излучение 10 вызывают изменения тшляпа не легко обнаружить в пробирке в экспериментальных временных рамок этих весьма жестких систем. В то время как такие путевки изменения эндотелия липкости клеток легко пропустили или уволены в пробирке, это не обязательно доброкачественные в естественных условиях, где такие небольшие изменения в пределах времени жизни, что характерно для хронического воспаления, может оказать весьма существенные результаты. Следовательно надежный, но чувствительный и специфичный метод для обнаружения и измерения эндотелия адгезия клеток необходим.Здесь мы приводим метод измерения адгезионной способности эндотелиальных клеток непосредственно. Этот метод не зависит от измерений флуоресценции в качестве косвенного индикатора суррогатной эндотелиальной клеточной адгезионной. Это показывает, являются ли изменения в липкости за счет равномерного изменения во всех клетках или прикован к югу от населения. Кроме того, это позволяет совместным окрашиванием эндотелиальных клеток с маркерами, такими как стареющих связаны бета-галактозидазы, жизнеспособность клеток к царапаниюкег, Calcien утра и антитела против клеточной поверхности и внутриклеточных белков, позволяющих объединение отдельных клеевых эндотелиальных клеток к определенным государств клеток или экспрессии специфических белков.
Адгезию моноцитов анализ, описанный выше, успешно используется в экспериментах, направленных на изучение биологических эффектов ионизирующего излучения на эндотелиальных монослоев 10. Хотя это не единственный метод, доступный для оценки адгезивность эндотелиальных монослоя, что это единственный способ, который позволяет количественно определить доли или процента эндотелиальных клеток в монослое, который клей. Это важное различие в качестве глобального количественного изменения в адгезии моноцитов, как измерено с помощью других методов можно отнести либо к общему росту адгезионной всех клетках эндотелия монослоя или с увеличением адгезионной субпопуляции клеток эндотелия в монослое, как показано в приведенном выше примере. Значение этой информации иллюстрируется на то, что способность количественно процент эндотелиальных клеток, которые показали повышенную адгезионную после облучения привело к INESспособны вывод, что этот эффект не является следствием генетической мутации определенного гена как процент клеток, которые были адгезив в значительной степени были выше (более 1000 раз больше) того, что можно было бы ожидать от случайной мутации гена от рентгеновского излучения в этой дозе ,
Фактор, который обеспечивает хорошую воспроизводимость результатов стиральная режим. Как процедура промывки включает в себя погружение покровного стекла в буфер стирки с последующим вытирая на ткани, изменчивость в буферной турбулентности, которая неизбежно возникает от старого метода пипетки промывочного буфера в лунку избежать. Действительно это было наблюдение чрезмерной изменчивости между повторами, полученных с помощью метода пипетки, что заставило нас разработать процедуру промывки, что удалены изменчивости элемента из стадии промывки.
Следует признать, что ограниченность этого анализа лежат в необходимости проведения ручной подсчет моноцитов кластеров, которые пOT чтобы его можно было адаптировать для высокой пропускной анализов. Во-вторых, решение о том, как много моноциты составляют кластер должен быть определен полу-произвольно и уровень может быть слишком высокой и привести к исключению некоторых подлинных кластеров. Отсутствие силы сдвига в этом способе можно также рассматривать как ограничение в экспериментах, в которых грубо повышенная адгезия эндотелиальных клеток, индуцированных (например, ФНО) +. В других ситуациях, однако, отсутствие силы сдвига является преимуществом, так как он позволяет обнаруживать менее преувеличенной увеличения клейкости. Модест увеличение моноцитов липкости может быть особенно важным и актуальным. В естественных условиях, моноциты бы не (в типичной экспериментальной времени), как ожидается, приложить в больших количествах эндотелиальных клеток со скромным ростом липкости, во многом благодаря сдвигу силу. В момент, однако, некоторые моноциты, вероятно, будет, и это более вероятно, представляют собой среду хронического воспаления. Как таковой,Отсутствие силы сдвига может быть преимуществом, так как это дает возможность для небольших увеличивается в эндотелиальных клеток липкости быть выявлены в экспериментальных временных рамок, которые, как правило, короткие и, возможно, слишком мимолетным, чтобы скромное увеличение адгезионной наблюдаться при напряжении сдвига.
Способность подвергать клетки после этого анализа в других анализах, таких как увядания анализа и иммунофлуоресцентного увеличивает полезность этого метода, поскольку он позволяет ассоциацию адгезионной конкретных эндотелиальных клеток в частности клеточных белков или клеточных состояний, как показано выше, функцию, которая не доступен с более старыми адгезии анализов.
Этот метод был использован с est2-увековечил человека коронарных эндотелиальных клеток и Аналогичные результаты были получены с первичных человеческих эндотелиальных клеток коронарных 10, демонстрируя, что он не является специфичным для просто конкретной клеточной линии. Кроме того, шумаавтомеханик этого метода количественного определения адгезионной способности эндотелиальных клеток не исключает подвергая те же клетки в стандартном тесте адгезии, который измеряет флуоресценцию меченых иммуноцитов. Вместе, этот доклад показывает, что этот метод является универсальным, всеобъемлющим и предоставляет гораздо больше информации, чем стандартный адгезии анализа.
The authors have nothing to disclose.
We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Hepes Buffered Saline Solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
Glass coverslips Round 12mm Diameter | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
24-well cluster plate | Costar | 3526 | |
Meso-Endo Cell media | Cell Applications | 212-500 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
Soybean trypsin inhibitor | Life Technologies | 17075-029 | |
Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
RPMI | Sigma | R8758 | |
Foetal Calf Serum | Life Technologies | 10500064 | |
Beta glasctosidase Assay kit | CellSignaling | 9860 | |
Fibronectin | Sigma | F0895 |