胚性メッケル軟骨でZebrabowクローン細胞分析によって軟骨細胞のインターカレーションと方向性増殖の可視化
Summary
頭蓋顔面骨の細胞組織が長いと仮定されず、直接可視化はありませんでした。マルチスペクトル細胞標識および in vivoライブで イメージングは、ゼブラフィッシュ下顎における動的な細胞の挙動の可視化を可能にします。ここでは、詳細プロトコルはZebrabowトランスジェニック魚を操作し、直接細胞のインターカレーションとメッケル軟骨における軟骨細胞の形態学的変化を観察します。
Abstract
脊椎動物頭蓋顔面構造の開発は、細胞遊走、増殖、接着および分化の正確な調整が必要です。メッケル軟骨のパターニングは、まず咽頭弓誘導体は、頭蓋神経堤（CNC）細胞およびプログレッシブパーティショニング、増殖および分化した軟骨細胞の組織の移行を伴います。いくつかの研究は、下顎の形態形成時にCNCの移行を説明しているが、軟骨細胞はメッケル軟骨の成長と拡張に組織を達成する方法の詳細は不明なままです。 SOX10制限され、化学的にCreリコンビナーゼ媒介組換えを誘発され、それによって別個のクローン集団を反映して、前駆細胞およびその子孫のマルチスペクトルラベルを作成し、個別の蛍光タンパク質（RFP、YFPとCFP）の順列を生成します。共焦点タイムラプス撮影を使用して、軟骨細胞を観察することが可能であるbehaviまたはゼブラフィッシュメッケル軟骨の開発中。
マルチスペクトル細胞標識は、メッケル軟骨細胞の拡張を実証するために、科学者を可能にします。下顎をprefiguresメッケル軟骨の延長フェーズでは、軟骨細胞は、彼らが組織的単細胞層状の列にスタックとして延長をもたらすためにインターカレートします。細胞伸長を媒介するこの組織的インターカレーションプロセスの失敗は、私たちは下顎の奇形で観察形成不全下顎のための細胞機構的説明を提供します。
Introduction
頭蓋顔面の開発は、細胞増殖、遊走および分化1,2、3を駆動するための複雑な分子、細胞および組織の相互作用を必要とします。この厳密に調節し、複雑なプロセスは、頭蓋顔面奇形は、最も一般的な先天性奇形1-9中にあるように、遺伝的および環境的摂動の対象となります。外科的介入は、開発の基礎を理解し、頭蓋顔面異常を治療の中心残っているが、将来の治療法を革新することが不可欠です。したがって、収束と拡張および細胞統合における形態形成および機構を研究することは、頭蓋顔面の骨格1の形成に新たな洞察を提供しています。
頭蓋神経堤は、下顎をprefiguresメッケル軟骨を形成するために、拡張ペアの下顎のプロセスを形成した後、最初の咽頭弓を移行し、移入します。形態形成Oメッケル軟骨F方向性増殖、細胞分極と分化1,10を経由して軟骨細胞組織を必要とします。しかし、メッケル軟骨の成長と拡張に軟骨細胞組織の複雑さは不明なままです。動的な細胞の挙動を理解することは、このような形成不全下顎の表現型11と下顎の大きさに影響する先天性奇形を、理解するために重要です。
ゼブラフィッシュの胚はメッケル軟骨の形態形成の詳細な研究のための多くの発達と遺伝的利点を提供します。彼らの遺伝的扱いやすさ、透明性、ex vivoでかつ急速な発展は、ライブイメージング6による細胞運動と組織の観察のためによく、それを貸し強力な利点です。そのようなSOX10などの系譜トレースツール、 使用 ：楓トランスジェニック系統を、私たちと他の人は、胚の頭蓋顔面の骨格1,5の神経堤起源を描写しています。 USIUBIでERT2-Creを：SOX10 ngを Zebrabow-Mトランスジェニック系統は、頭蓋顔面の開発中の細胞の動きを詳細に探索することが可能になりました。 Zebrabow-Mは、異なる蛍光体の発現を駆動するユビキチンプロモーター、lox部位8が隣接し、それぞれに操作されたトランスジェニックラインです。 Zebrabow-Mのデフォルトのフルオロフォアは、RFPを発現し、レッドです。 Cre発現の誘導後、Zebrabow-Mは、再結合を構築し、細胞が胚におけるマルチスペクトル式を作成する異なる蛍光体（RFP、CFPとYFP）の組み合わせを発現します。別の並置された前駆細胞に由来する細胞集団がクローンラベル付けされるように、再結合イベントの後に標識された細胞から分裂し、すべての娘細胞は、その後、クローン、標識されています。このクローン細胞標識によって、クローンの解像度を有する細胞の増殖及び遊走（図1 及び2）に従うことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
アルシアンブルーとphotoconvertibleトランスジェニック系統前述したように、軟骨と骨の発達の複雑なプロセスを定義するためにお互いを補完します。しかし、器官形成時のライブ細胞移動および組織が長く仮定し、間接的に実証されたが可視化されませんされています。軟骨特定のCreと相まってZebrabow-Mトランスジェニックラインは、骨および軟骨形成に関与するすべてのこれらの個別のイベ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、親切に魚の施設や線の優れたケアのためZebrabow-Mトランスジェニック系統、pDestにベクトルのジェフリー・バーンズとレニーエティエ-Daigle氏を共有するためのアレックスSchierに感謝します。
資金調達：
私たちは、シュライナーズ子ども病院から子供（ECL）とポスドク研修フェローシップのためNIDCR RO3DE024490とシュライナーズホスピタルからの寛大な資金援助（LRとYK）のために感謝しています。
Materials
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μL stock aliquots at 50mg/mL |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Equipments | |||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
Referenzen
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