ميكروفلويديك Genipin ترسب تقنية للثقافة الموسعة من Micropatterned الأوعية الدموية العضلات الرقيقة
Summary
We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.
Abstract
The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.
Introduction
أمراض الأوعية الدموية، مثل بالتشنج الدماغي 1،2 وارتفاع ضغط الدم 3، وتصلب الشرايين 4، تتطور ببطء، هي المزمنة عادة في الطبيعة، وتنطوي على توليد قوة مختلة من قبل خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs). ونحن نهدف إلى دراسة هذه الاختلالات الأوعية الدموية بطيئة التقدم باستخدام أساليب المختبر مع تحكم أكثر دقة من الظروف التجريبية منه في في النماذج الحية. وقد وضعنا سابقا الأوعية الدموية الأغشية الرقيقة العضلات (vMTFs) لقياس انقباض وظيفية في المختبر هندستها الأنسجة القلب والأوعية الدموية 5، ولكن تم هذا الأسلوب تقتصر على الدراسات نسبيا على المدى القصير. هنا، نقدم تقنية تعديل الركيزة التي تقوم بتوسيع أسلوبنا vMTF السابقة لقياس المدى الطويل.
في حين أن البطانة هي حاسمة أيضا في وظيفة الأوعية الدموية الشاملة، المهندسة صفائح الشرايين توفير نظام نموذجا مفيدا لتقييم التغيرات في الأوعية الدمويةانقباض أثناء تطور المرض. لهندسة الأنسجة الوعائية نموذج مرض وظيفي، فإن كلا من هيكل ووظيفة الصفيحة الشرايين، وحدة مقلص الأساسية للسفينة، يجب تلخيصها مع الدقة العالية. الشرياني صفائح متحدة المركز، وصحائف الانحياز محيطي من VSMCs مقلص مفصولة ورقة من الإيلاستين 6. microcontact الطباعة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات على polydimethylsiloxane (PDMS) ركائز تم استخدامها سابقا لتقديم العظة التوجيه في تنظيم أنسجة لتقليد الانحياز أنسجة القلب والأوعية الدموية 5،7-10. ومع ذلك، أنسجة منقوشة باستخدام microcontact الطباعة يمكن أن تفقد سلامة بعد 3-4 أيام في الثقافة، مما يحد من إمكانية تطبيقها في الدراسات المزمنة. يوفر هذا البروتوكول إلى حل لهذه المشكلة عن طريق استبدال تقنيات microcontact الطباعة السابقة مع تقنية ترسيب ميكروفلويديك جديدة.
Genchi وآخرون. PDMS ركائز تعديل مع genipin وواوند لفترات طويلة جدوى myocytes تصل إلى شهر واحد في الثقافة 11. هنا، فإننا نستخدم نهجا مماثلا لتوسيع ثقافة خلايا العضلات الملساء الوعائية منقوشة على PDMS. Genipin، وهو مشتق حلمهي الطبيعية من الفاكهة الغردينيا، هو المرشح المرغوب فيه تعديل الركيزة نظرا لسمية منخفضة نسبيا بالمقارنة مع وكلاء يشابك مماثلة، والاستخدام المتزايد بوصفها مادة بيولوجية في مجالات إصلاح الأنسجة 12،13 وECM تعديل 14، 15. في هذا البروتوكول، ويستخدم فبرونيكتين باعتباره جديلة توجيه الخلايا، كما هو الحال في وسائل microcontact الطباعة السابقة؛ ومع ذلك، وتودع genipin على PDMS ركائز قبل فبرونيكتين الزخرفة. وهكذا، كما تتحلل خلايا المصفوفة المزخرفة، ECM تصنيعه حديثا من VSMCs المرفقة يمكن ربط المغلفة genipin PDMS الركيزة.
هذا البروتوكول يستخدم جهاز تسليم ميكروفلويديك لمن خطوتين genipin وECM الترسيب. تصميم يحاكي جهاز ميكروفلويديك microcoأنماط الطباعة ntact تستخدم لالمهندسة صفائح الشرايين في الدراسات السابقة 16. وبالتالي، فإننا نتوقع هذا البروتوكول لتسفر يقلد صفائح الدم التي تلخص بنجاح الانحياز للغاية في بنية الجسم الحي وظيفة مقلص من صفائح الشرايين. نحن أيضا تقييم انقباض الأنسجة للتأكد من أن genipin هو مناسب مجمع تعديل الركيزة على المدى الطويل في المختبر نماذج أمراض الأوعية الدموية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نقدم البروتوكول الذي يبني على التكنولوجيا vMTF التي سبق وضعها، مما يسمح مرات التجربة الممتدة أكثر نموذجية من مسارات مرض الأوعية الدموية المزمنة 1،23،24. لتحقيق ذلك، ونحن micropattern genipin، التي سبق أن ثبت أن توفير functionalization على المدى الطويل من ركائز PDMS 11، وذلك …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge financial support from the American Heart Association Scientist Development Grant, 13SDG14670062 (PWA) and the University of Minnesota Doctoral Dissertation Fellowship (ESH). We also acknowledge the microfabrication resources of the Minnesota Nano Center (MNC) and the image processing resources of the University Imaging Centers (UIC), both at the University of Minnesota. Parts of this work were carried out in the Characterization Facility, University of Minnesota, which receives partial support from NSF through the MRS program.
Materials
| Coverslip staining rack | Electron Microscopy Sciences | www.emsdiasum.com/ | 72239-04 | Alternative coverslip rack may be used |
| Microscope cover glass – 25 mm | Fisher Scientific, Inc. | www.fishersci.com | 12-545-102 | Alternative brand and size may be used; Microscope slides may also be substituted as substrate base |
| Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Polysciences, Inc. | www.polysciences.com/ | #21458 | Sigma-Aldrich makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol; Compound gives strong odor, use proper ventilation |
| 1-butanol | Sigma-Aldrich | www.sigmaaldrich.com | 360465 | Hazard: flammable (store stock solution in flammable cabinet); flash point is 37 °C, avoid heating; alternative product may be used |
| Spincoater | Specialty Coating Systems, Inc. | www.scscoatings.com | SCS G3P8 Model; Alternative brand and/or model may be used | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Alternative distributor may be used |
| Fluorescent microbeads | Polysciences, Inc. | www.polysciences.com/ | 17151 | Alternative brand and/or larger size may be used |
| Silicon wafers | Wafer World, Inc. | www.waferworld.com | 2398 | Alternative brand and/or size may be used |
| Photoresist | MicroChem Corp. | www.microchem.com | SU-8 3025 allows 20-25-µm feature height | |
| Contact mask aligner | Suss MicroTec | www.suss.com | MA6 contact mask aligner; alternative brand and/or model may be used for wafer exposure | |
| Developer | MicroChem Corp. | www.microchem.com | SU-8 Developer; Hazard: flammable | |
| Tridecafluro-trichlorosilane | UCT Specialties, Inc. | www.unitedchem.com | T2492 | Silane for non-stick coating of patterned silicon wafers (CAUTION: Tridecafluro-trichlorosilane is a flammable and corrosive liquid. Proper personal protective equipment and local exhaust is necessary for use. ) |
| Surgical biopsy punch | Integra LifeSciences Corp. | www.miltex.com | 33-31AA-P/25 | Alternative brand and/or size may be used |
| Genipin | Cayman Chemical | www.caymanchem.com | 10010622 | Sigma-Aldrich (G4796-25MG) makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol |
| 1X phosphate buffered saline | Mediatech, Inc. | www.cellgro.com | 21-031-CV | Alternative brand may be used |
| Fibronectin | Corning, Inc. | www.corning.com | 356008 | Sigma-Aldrich (F1056) makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Inc. | www.lifetechnologies.com | 15140-122 | Alternative brand and/or size may be used, as long as concentration is the same |
| Umbillical artery smooth muscle cells | Lonza | www.lonza.com | CC-2579 | Alternative cell types may be used for alternative applications. Media should be modified accordingly |
| Tyrode's solution components | Sigma-Aldrich | www.sigmaaldrich.com | various | Alternative brand may be used for mixing solution |
| Stereomicroscope | Zeiss | www.zeiss.com | 4350020000000000 | SteREOLumar V12; Alternative brand/type of stereomicroscope may be used |
| Temperature-controlled platform | Warner Instruments | www.warneronline.com | 641659; 640352; 641922 | |
| Endothelin-1 | Sigma-Aldrich | www.sigmaaldrich.com | E7764-50UG | Alternative amount may be purchased, as long as treatment concentration is maintained |
| HA-1077 | Sigma-Aldrich | www.sigmaaldrich.com | H139-10MG | Alternative amount may be purchased, as long as treatment concentration is maintained |
Referenzen
- Humphrey, J. D., Baek, S., Niklason, L. E. Biochemomechanics of cerebral vasospasm and its resolution: I. A new hypothesis and theoretical framework. Ann. Biomed. Eng. 35, 1485-1497 (2007).
- Hald, E. S., Alford, P. W. Smooth muscle phenotype switching in blast traumatic brain injury-induced cerebral vasospasm. Transl. Stroke Res. 5, 385-393 (2014).
- Olivetti, G., Anversa, P., Melissari, M., Loud, A. V. Morphometry of medial hypertrophy in the rat thoracic aorta. Lab. Invest. 42, 559-565 (1980).
- , Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
- Rhodin, J. A. G., ed, B. e. r. n. e. ,. R. .. ,. Architecture of the vessel wall. Physiol. Rev. , (1979).
- Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 19943-19948 (2011).
- Grosberg, A., Alford, P. W., McCain, M. L., Parker, K. K. Ensembles of engineered cardiac tissues for physiological and pharmacological study: heart on a chip. 11, 4165-4173 (2011).
- Alford, P. W., Nesmith, A. P., Seywerd, J. N., Grosberg, A., Parker, K. K. Vascular smooth muscle contractility depends on cell shape. Integr. Biol. (Camb). 3, 1063-1070 (2011).
- Win, Z., et al. Smooth muscle architecture within cell-dense vascular tissues influences functional contractility). Integr. Biol. (Camb). , (2014).
- Genchi, G. G., et al. Bio/non-bio interfaces: a straightforward method for obtaining long term PDMS/muscle cell biohybrid constructs). Colloid Surface B. 105, 144-151 (2013).
- Fessel, G., Cadby, J., Wunderli, S., van Weeren, R., Snedeker, J. G. Dose- and time-dependent effects of genipin crosslinking on cell viability and tissue mechanics – Toward clinical application for tendon repair. Acta Biomater. , (2013).
- Lima, E. G., et al. Genipin enhances the mechanical properties of tissue-engineered cartilage and protects against inflammatory degradation when used as a medium supplement. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 692-700 (2009).
- Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. J. Biomed. Mater. Res. A. , (2011).
- Satyam, A., Subramanian, G. S., Raghunath, M., Pandit, A., Zeugolis, D. I. In vitro evaluation of Ficoll-enriched and genipin-stabilised collagen scaffolds. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2012).
- Alford, P. W., et al. Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 12705-12710 (2011).
- Song, H., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. A microfluidic system for controlling reaction networks in time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 768-772 (2003).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. Long-term vascular contractility assay using genipin-modified muscular thin films. Biofabrication. 6, 045005 (2014).
- Han, M., Wen, J. K., Zheng, B., Cheng, Y., Zhang, C. Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C50-C58 (2006).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Volfson, D., Cookson, S., Hasty, J., Tsimring, L. S. Biomechanical ordering of dense cell populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15346-15351 (2008).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis. Hypertension. 38, 581-587 (2001).
- Kayembe, K. N., Sasahara, M., Hazama, F. Cerebral aneurysms and variations in the circle of Willis. Stroke. 15, 846-850 (1984).
- McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
- Weir, B., Grace, M., Hansen, J., Rothberg, C. Time course of vasospasm in man. 48, 173-178 (1978).
- McCain, M. L., Sheehy, S. P., Grosberg, A., Goss, J. A., Parker, K. K. Recapitulating maladaptive, multiscale remodeling of failing myocardium on a chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9770-9775 (2013).
- Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).
- Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).
- Meer, A. D., van den Berg, A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).
