Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.
Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.
Области регенеративной медицины и тканевой инженерии быстро развивается, с прорывами в трахеи и почек регенерации два заметных последних достижений. Биоматериалов, разработанные в тканевой инженерии становятся все более доступными, с возможностями для передачи таких протоколов до менее специализированных лабораториях. Одно поле заливают пользу путем увеличения использования биоматериалов в пробирке диагностики.
В пробирке исследования являются важной платформой для расследования внутриклеточных сигнальных путей в пределах одного типов клеток, и помогли очертить механизмы, лежащие в основе многочисленных pathophysiologies болезни. Эти исследования как правило, зависят от одного типа клеток культивируются в монослое на тканевой культуры пластика (TCP); двумерное (2D) жесткая поверхность пор менее эластичной и пористой, чем трехмерных (3D) среды клетки подвергаются воздействию в ткани или органе. Животные модели традиционно электроннойmployed, чтобы подтвердить эффекты, обнаруженные в пробирке и перевести всей ткани, а также может быть использован в качестве доклинических платформы для исследования заболеваний человека. Тем не менее, различия межвидовых подорвать эту зависимость на животных моделях в нашем понимании человеческой болезни -. Например, сколько понимание астмы болезни легких основан на модели мыши, несмотря на присущих различий между человеческим состоянием и этой модели в том числе мало доказательств из тучных клеток инфильтрации дыхательных путей гладкой мышечной пучка, или способности к развитию спонтанного заболевания у животного модели 3,4. Есть также этические соображения, касающиеся использования животных моделях, с "3RS" стандарт "замены, уточнения и сокращения» экспериментов на животных поощряется в Великобритании и других странах.
Привлекательной альтернативой будет повторение человеческих тканей в лабораторных структуры создающейс исследовать кооперативный характер между взрослыми типов клеток человека в единое целое. Клетки существуют в 3D многоклеточных структур в тканях, каждый в уникальном микро-среды. Культивирование клеток на TCP позволяет только культуру клеток монослоя, не в состоянии воспроизвести эту среду, или предоставить возможности для мульти-клеточной культуре. Биоматериалов продвижение дает возможность развиваться как природные, так и синтетические 3D платформы для клеточной культуры. Decellularized ЕСМ могут быть использованы для 3D культуры клеток при recellularized с других типов клеток, включая стволовые клетки 1, однако такие протоколы могут быть сложными и трудоемкими, при наличии ограниченных ткани и в значительной степени из нечеловеческого происхождения. Другие протоколы позволяют больший контроль над клеточными условиях, созданных, например, наноимпринтной, осаждения ECM, клетки листовых технологий, или электропрядения. Электропрядения создает нетканые 3D пористые коврики волокон диаметром от нанометра до микрометра, гeplicating природные размеры ECM. Все чаще используется Electrospun леса, как 3D культивирования клеток платформ -. Манипуляция электропрядения параметров позволяет контролировать сложную лесов характеристик, таких как размер пор, диаметр волокна, топографии и выравнивания поверхности и химии. Изменения таких параметров, как было показано, непосредственно влияют на клеточную адгезию и рост, когда клетки культивировали в изоляции.
Эти преимущества были использована в настоящем исследовании, чтобы позволить культивирование нескольких типов клеток в виде одного 3D конструкции ткани, используя бронхиолы дыхательных путей в качестве модели 3D структуры ткани. Бронхиола стенка состоит из трех основных регионах (рисунок 1). Слизистая оболочка дыхательных путей, где эпителиальные клетки сидеть на воздух-жидкость интерфейса (ALI), обеспечивая важный барьер к внешней среде. Они проживают на ретикулярная базальной мембраны (УОР), плотно компактный ЕСМ состоит в основном из collagан И.В., perlecans и ламинины. Суб-слой слизистой находится непосредственно под слизистой, более пористой области, состоящей из нескольких типов клеток, включая фибробласты, миофибробластов и Лейкоциты проникают в условиях болезни. Наконец гладкомышечных пучков обернуть вокруг дыхательных путей в виде спирали, и состоят из выровненных листов гладких мышц дыхательных путей (ASM). Это относительное состояние сократительной гладкомышечных, что контролирует тон дыхательных путей. Занятости electrospun лесов в легочной системы до недавнего ограничивается регенеративных целей; с electrospun замена трахеи успешно пересадили. Несмотря на то, успешно, такие методы лечения ограничены в числе, и ориентированы на трахею из-за относительной простой характер функции ткани в. Ограниченные примеры моделей дыхательных путей, используемых для диагностики в пробирке существует, и, в основном, сосредоточены на измерениях гладких мышц,. Нетоксичным и нен-разложению полимер полиэтилентерефталат (ПЭТ) ранее electrospun, и был использован в настоящем исследовании, чтобы обеспечить каркасы, произведенные можно хранить в течение длительного времени без ухудшения (что позволяет им быть использованы "с полки"), а также подходит Для стабильной клеточной культуры в течение длительных периодов времени. Предыдущие исследования из нашей группы продемонстрировали, что использование трех вариаций базовой протокола электропрядения, три отдельные каркасы ПЭТ electrospun может быть произведено, чтобы обеспечить оптимальные топографии для эпителиальных культивирование фибробластов дыхательных путей, и гладкие мышечные клетки в изоляции 21,22 и совместного культивирования дыхательных путей эпителиальные и фибробласты 22. Диаметр волокна было установлено, значительно влияет на эпителиальную функциональность 22, и выравнивание волокон позволило поколение выровненных листов гладких мышц 21. Эти исследования проводились независимо друг от друга в статических условиях. В настоящем исследовании, эти differeNT каркасы, содержащие полностью дифференцированные клетки взрослого человека были совместно культивировали в течение одной недели в ALI в коммерчески доступном биореакторе в качестве секции 3D стенки дыхательных путей, обеспечивая физиологически соответствующие модели в пробирке для исследования дыхательных путей между клеточные ответы. Хотя это протокол с использованием бронхиолы дыхательных путей в качестве модельной системы, она может быть адаптирована в качестве платформы для совместного культивирования 3D слизистой оболочки блоков из других органов.
Возможность electrospin полимерные волокна с структурными свойствами, сравнимыми с естественной ECM привело к многочисленным природных или синтетических полимеров, или смесей полимеров, являющихся electrospun воссоздать эти среды,. Манипуляции с параметрами процесса (в том числе полимерной выбора, концентрации полимера, растворителя, кончик иглы расстояния и температуры) могут все влияние лесов характеристик; Однако некоторые параметры могут иметь большее влияние на эшафот свойствами, чем другие 25,. При изменении диаметра волокна ПЭТ, мы обнаружили, ключевые параметры, чтобы быть концентрация полимера использовали, скорость, с которой полимерный раствор electrospun, и диаметр иглы в. При электроформования выровненных волокон ключевые параметры используется метод сбора (вращающейся оправке), и скорость, с которой вращается оправка. В результате уменьшения скорости оправки 60 оборотов в минуту, мы обнаружили, что случайно выравненные леса, произведенные показали большую эшафот UNIветствия сравнению с электроформования на плоскую пластину коллектора.
Характеристики decellularized ткани дыхательных путей были проанализированы, чтобы обеспечить руководство для различных топологий лесов, разработанных для культуры каждого дыхательных путей типа клеток. Electrospun нановолокна привлекательным эшафот повторить подвал мембранных структур из-за малого размера пор, но высокой общей пористости, что позволяет увеличить метаболита диффузии в то время ограничивая клеточный движение. 9 Хотя оптимизации параметров электропрядения, диапазон концентраций ПЭТ и расходов были протестированы. Тончайшие волокна достигается с помощью 6% раствор вес / объем ПЭТ, ранее используемый другими группами. Тем не менее, высокий уровень бисером, и отсутствие единообразия были постоянные проблемы. Первоначальные попытки удалить бисером включены добавлением катионного поверхностно-активного вещества, бромид цетилтриметиламмония (СТАВ), к раствору, чтобы снизить поверхностное натяжение, и тестирования различных источниковПЭТ. Добавление поверхностно-активного вещества уменьшается количество бисером, но не полностью. После попытки ряда коммерческих источников ПЭТ гранул, пищевой напиток бутылка ПЭТ используется, сокращая до бутылки напитки и растворения их в DCM: TFA решения растворителя. Используя это как привели источник ПЭТ в увеличении волокна однородности и снижение волокна бисером. Слегка увеличивая концентрацию раствора до 8% вес / объем, и уменьшение диаметра иглы (18G к 23G) мы последовательно производится бездефектных нановолокна с диаметром волокон примерно 250 нм. Electrospun нановолокон леса может быть очень электростатического при сборе с оправки решений ручной обработки каркасов сложных. Это было улучшено путем хранения каркасов в алюминиевую фольгу после вращения и замачивания в 70% IMS перед использованием. Это, казалось, чтобы помочь рассеять остаточное электростатический заряд оставил на эшафот из процесса электропрядения.
Для обеспечения верхographies похож на отдельных микросреды, с которыми сталкиваются три основных типа клеток дыхательных путей в пределах стенке дыхательных путей, основной протокол электропрядения был адаптирован производить три уникальные каркасов для этих типов клеток: по электропрядения низкий концентрация раствора ПЭТ медленно, были сгенерированы случайным образом выровнены нановолокна, на котором эпителиальные клетки высевали (имитируя УКР). По электроформования более высокую концентрацию раствора ПЭТ более быстрыми темпами, были сгенерированы случайным образом выровнены микроволокна (производить более пористого матрикса), в котором фибробласты высевали (имитируя суб-слизистой область непосредственно под УКР). По электроформования низкую концентрацию раствора ПЭТ на высокой скорости вращающейся оправке выровнены нановолокна были произведены, на которой гладкомышечные клетки ориентированы в направлении волокон, производство листов выровнены клеток.
Увеличение диаметров волокон приводит к увеличению размера пор, что позволяет более penetratio клетокп в каркасах и да поможет создать настоящий 3D-среде,. Микрофибры леса были заняты для культуры фибробластов в исследовании для того, чтобы клетки жили на нескольких плоскостях внутри эшафот. При увеличении концентрации ПЭТ до 30% вес / объем, ПЭТ волокна со средним диаметром 2,5 мкм были получены. Волокна большего диаметра (≈ 4 мкм) были получены с использованием 35% раствора ПЭТ вес / объем, но толщина эшафот однородность погиб, и выше изменчивость между отдельными волокнами было очевидно. Поры в микроволокна помост было более 7 раз больше, чем измеренные в нановолокон каркасов (10,45 мкм против 1,43 мкм соответственно), но по-прежнему статического посев клеток при условии, ограниченное проникновение сотовой. Это была улучшена за счет динамического посева клеток с использованием орбитальной смеситель, способ, показанный, чтобы быть эффективными ранее.
Высоко выравненные нановолокон леса были созданы электропрядения 10%вес / объем раствора ПЭТ на оправку вращающегося со скоростью 2000 оборотов в минуту (≈ 440 м · мин -1). Концентрация ПЭТ был увеличен с 8%, чтобы предотвратить неправильную волнообразный морфологию, что волокна выставлены при более низких концентрациях. Несмотря на увеличение концентрации, выравнивая волокна уменьшается средний диаметр волокна (216 нм против 255 нм, выровненный против случайных). Высокая скорость оправки рисунок волокон, прежде чем они высохли может вызвать этот эффект. Выравнивание волокон под влиянием выравнивание ASM клеток, а также имеет другие физиологические эффекты на АНМ клеток, которые были характерны в других местах 21.
Основным недостатком этого протокола является невозможность изображения живых клеток в / в каркасах делает первоначальный клеток-вложение или дифференциацию в течение длительного периода времени невозможно определить без ущерба для образцов. Это означает, что большинство оптимизация происходит после периода культивирования, то есть исправитьIng образцы, а затем измерения ли культура клеток успешно после не при культивировании клеток. Наблюдая изменение цвета в каркасах инкубировали в AlamarBlue (синий) до розового указывает клетки присутствуют и жизнеспособной, но не является идеальным. Электроформования более прозрачные полимеры, такие как желатин может помочь в визуализации клеток на каркасах. Электроформования из нановолоконные помост в нашей модели позволило репликацию УКР дыхательных путей, так же, состоящий из плотных нановолокон, на которой эпителиальные клетки находятся. Ранее было показано, что структурные элементы не могут мигрировать через нановолокна помост 22, хотя иммунные клетки способны (данные не показаны). Хотя предпочтительным для культивирования конкретных типов клеток на 3D поверхности (например, эпителиальные и эндотелиальные клетки), это предотвращение структурной клеточной миграции через нановолокон может быть вредным для культивирования клеток других типов. Как гладкие мышцы не в состоянии мигрировать через йе выровнены нановолокна леса мы собрали три-слоистых совместного культивирования с гладкой мышцы и фибробластов слоев, обращенных друг к другу (в отличие от выровненного эшафот, разделяющей два типа клеток). Хотя это позволяет клеткам быть близко друг, текущее исследование не может заключить ли один тип клеток (или фибробластов или гладкомышечных) обгонит весь слой над более длительного периода культивирования. Несмотря на эти ограничения, жизнеспособным трехслойное модель стенке дыхательных путей была разработана, что обеспечивает альтернативный платформу для исследования взаимодействия между этими нескольких типов клеток. Аналогичное три-слоистой исследования был недавно опубликован, где фибробласты были встроены в цилиндрическую коллагена I гидрогеля с гладкой мускулатуры высевают на наружной поверхности эпителиальных клеток и внутри просвета поверхности 17. Механическую стабильность electrospun каркасов развитых здесь позволит подобное трубчатые конструкции, который будет сформирован, и остается тока исследовRCH цель в нашей группе. Несмотря на то, исследование было сосредоточено на дыхательные пути, органы несколько в пределах доли тела это основное структурное подразделение слизистой, а через изменения арендаторов подчеркнул в этом исследовании, аналогичные платформы могут быть разработаны для тканей, содержащих базальной мембраны блок в том числе кровеносных сосудов, мочевого пузыря и Роговица, где были использованы основанные многослойные модели коллаген.
The authors have nothing to disclose.
The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement n° 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.
Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
FCS | Gibco | Media supplement | |
Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |