3D Гидрогель Строительные леса для суставной хондроцит культуры и хряща поколения

Summary

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

Abstract

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Introduction

With its limited self-repair potential, human articular cartilage undergoes frequent irreversible damages. Extensive efforts are currently focused on the development of efficient cell-based approaches for treatment of articular cartilage injuries. The success of these cell-based therapies is highly dependent on the selection of an optimal cell source and the maintenance of its regenerative potential. Chondrocytes are a common cell source for cartilage repair, but they are limited in supply and can de-differentiate during in vitro expansion in 2D monolayer culture thereby limiting their generation of hyaline cartilage ¹.

The aim of this protocol is to establish a 3-dimensional hydrogel platform for an in vitro comparative study of human chondrocytes from different ages and disease state. Unlike conventional two-dimensional (2D) culture, three-dimensional (3D) hydrogels allow chondrocytes to maintain their morphology and phenotype and provides a physiologically relevant environment enabling chondrocytes to produce cartilage tissue ^2,3. In addition to providing a 3D physical structure for chondrocyte culture, hydrogels mimic the function of native cartilage extracellular matrix (ECM). Specifically, the inclusion of chondroitin sulfate methacrylate provides a potential reservoir for secreted paracrine factors ⁴ and enables cell-mediated degradation and matrix turnover ⁵. Although many 3D hydrogel culture systems have been utilized widely in various studies including agarose and alginate gels, we have used a biomimetic 3D culture system that has some distinct advantages for chondrocyte culture. Chondroitin sulfate (CS) is an abundant component in articular cartilage and the PEG-CS hydrogels have been shown to maintain and even enhance chondrogenic phenotype and facilitate cell-mediated matrix degradation and turnover ^2,5. In addition, the mechanical properties of the hydrogel scaffold can be easily modulated by changing concentration of PEG and hence can be utilized to further enhance the regeneration potential of chondrocytes or a related cell type ^6,7. PEG/CSMA is also biocompatible and hence has the potential for a direct clinical application in cartilage defects for example. The limitation for this system is its complexity and the use of photopolymerization that can potentially affect cell viability as compared to simpler systems like agarose, however the advantages for the chondrocyte culture outweigh the potential limitations.

The 3D hydrogel culture is compatible with conventional assay for evaluation of cell phenotype (gene expression, protein immunostaining) and functional outcome (quantification of cartilage matrix production, mechanical testing). This favorable 3D environment was tested to compare the tissue regeneration potential of human chondrocytes from three different aged populations in long-term 3D cultures.

The outcomes were evaluated via both phenotypic and functional assays. Juvenile, adult and OA chondrocytes showed differential responses in the 3D biomimetic hydrogel culture. After 3 and 6 weeks, chondrogenic gene expression was upregulated in juvenile and adult chondrocytes but was downregulated in OA chondrocytes. Deposition of cartilage tissue components including aggrecan, type II collagen, and glycosaminoglycan (GAG) was high for juvenile and adult chondrocytes but not for OA chondrocytes. The compressive moduli of the resulting cartilage constructs also exhibited similar trends. In conclusion, both juvenile and adult chondrocytes exhibited chondrogenic and cartilage matrix disposition up to 6 weeks of 3D culture in hydrogels. In contrast, osteoarthritic chondrocytes revealed a loss of cartilage phenotype and minimal ability to generate robust cartilage.

Protocol

Все эксперименты были проведены в соответствии с руководящими принципами испытуемых Стэнфордский университет человека »и утвержден протокол Экспертный совет. 1. Суставной хондроцитов Изоляция Получить хрящ из ткани, выброшенных во время тотального эндопротезирования коленного сустава и анализировать, как описано ранее 8. Визуально выбрать медиальной или боковой бедренной мыщелков образцов хряща для гладких поверхностей и сделать разрез на поверхности хряща через скальпелем, чтобы удалить 4-5 мм хряща биопсии без воздействия субхондральной кости. Изолировать хондроциты из внеклеточного матрикса путем ферментативного разложения ткани с O / N лечении очищенной коллагеназы. Использование соотношении 1: 1 коллагеназы II (125 Ед / мл) и коллагеназы IV (160 Ед / мл) в среде роста хондроцитов при 37 ° С. На следующий день, фильтровать переваренной ткани, содержащей клетки диссоциированных через 70мм размер пор нейлоновая сетка. Промыть два раза с 20 мл DMEM / F12 и центрифуге при 600 х г в течение 5 мин. Пластина изолированных хондроциты при плотности 1 х 10 6 клеток / 60 мм чашки для культивирования следующие ресуспендирования в DMEM / F12, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 25 мкг / мл аскорбата, 2 мМ L-глутамина, противомикробных препаратов (100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,25 мкг / мл фунгизона). Хранить пластин при 37 ° С и поддерживают культуры хондроцитов первичные как высокой плотности монослоя до инкапсуляции в биомиметические гидрогелей. 2. Биомиметический Гидрогель Изготовление Примечание: Этот метод позволяет синтез биомиметического гидрогеля, содержащего поли (этиленгликольдиакрилат) (PEGDA, МВт 5000 г / моль), хондроитин сульфат-метакрилат (CS-MA) в DPBS. Добавление фотоинициатора позволяет фотоактивированного сшивание. Окончательный состав гидрогеля содержит 7% вест / объем (вес / объем) PEGDA, 3% вес / объем CS-MA и 0,05% вес / объем фотоинициатора. Обобщить CS-MA по функционализации полимера CS с метакрилатными групп. Подготовка буферного раствора 50 мМ 2-morpholinoethanesulfonic кислоты (MES) и 0,5 М хлорида натрия (NaCl) путем растворения 1,952 г MES и 5,84 г NaCl в 200 мл деионизированной воды (DIH 2 O). Растворяют 5 г хондроитинсульфата натриевой соли в буферном растворе. Добавить 0,532 г (4,62 ммоль) N-гидроксисукцинимид (NHS) и 1.771 г (9,24 ммоль) 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) (мольное соотношение NHS: EDC = 1: 2) в раствор и перемешивают в течение 5 мин. Добавить 0,765 г (4,62 ммоль) 2-аминоэтил-метакрилат (AEMA) (мольное соотношение NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) к раствору и поддержания реакции при КТ в течение 24 ч. Очищают смесь путем диализа против деионизированной воды (DIH 2 O) в течение 4 дней с использованием диализа (12-14 кДа MWCO). Фильтр рurified раствора через фильтр 0,22 мкм и помещают в открытые пробирки, содержащие раствор в эксикаторе и вакуумной O / N. Убедитесь, что все трубки защищены от света. Храните растворенного полимера при -20 ° С защищен от света и влаги. 3. Сотовый инкапсуляции Автоклав ПЦР кино и цилиндрические стержни (для пробивания клеточных нагруженные 3D гидрогели) и стерилизовать на заказ цилиндрическую форму геля погружением в 0,2 мкм фильтрованной 70% этанола в ткани капот культуры в УФ-свете. Уплотнение дна геля формы с автоклавного ПЦР пленки без воздушных пузырьков и зазоров для предотвращения утечек. Храните ее в стерильной 150 мм пластины. На следующий день перед клеток инкапсуляции в биомиметического гидрогеля, отделить высокой плотности монослоя хондроцитов с O / N в лечении коллагеназы II и решения Коллагеназа IV. Используйте 125 ед / мл коллагеназы для II и 160 U / мл коллагеназы для VI каждый роста хондроцитов СМИпри 37 ° С. Возьмем 50 мл трубки и добавить 5% вес / объем (в / о) поли (этиленгликольдиакрилат) (PEGDA, ММ = 5000 г / моль), 3% вес / объем хондроитинсульфат-метакрилат (CS-MA), и 0,05% вес / об фотоинициатора в DPBS. Vortex трубку для смешивания раствора и держать его в сторону. Защитите трубки от света. Сбор разложенных клеток в 50 мл Сокол трубки, рассчитывать и центрифуги при 460 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте все средства массовой информации от клетки пробирку и добавляют выше смешанного геля, повторно приостанавливать клетки при плотности 15 × 10 6 клеток / мл. Смешайте его в 30 раз тщательно избегая пузырьков воздуха образование. Внесите 72 мкл клеточной суспензии гидрогеля-или только гидрогеля в заказ форму цилиндрической гель и вызывают гелеобразование в результате воздействия УФ-излучения (длина волны 365 нм) в 3 мВт / м 2 в течение 5 мин. Подготовить гидрогеля решение без содержимого ячейки. Используйте эти конструкции в качестве отрицательного контроля для будущего биохимических и механических испытаний. MeasuRe интенсивности ультрафиолетового света с измерителем интенсивности УФ. Для регулировки интенсивности, изменить расстояние между УФ источником света и гидрогеля эшафот во время гелеобразования. Примечание: Так как гидрогель содержит CS, бесклеточная вклад вычитается из биохимического состава ГАГ клеточных нагруженные гидрогели представляют только клеточный GAG. Используйте скальпель, чтобы сократить фильм для легкого пилинга от и тщательно удалите его. С помощью цилиндрических стержней, вытолкнуть гель в луночный планшет 6 5 мл стерильной ДЗФР смывать Неполимеризованные гель и свободные клетки. Культура клеток гидрогели нагруженные в 24-луночных планшетах, содержащих 1,5 мл роста хондроцитов сред в каждую лунку. Использование одноразовых шпатель для передачи промытых гидрогели в скважину. Оценка жизнеспособности клеток живой мертвой окрашивание 24 ч после инкапсуляции с использованием набора жизнеспособность / цитотоксичность. Культура клеточные Ладена гидрогели и пустые гидрогели для 3-6 недель изменение свежие хондроцитов GROт-й СМИ каждые 2 дня до сбора урожая для анализа. 4. Экстракция РНК и экспрессия генов анализ Тщательно аспирата СМИ и поставить стерильную PBS 1X на клетки-Ладена, а также пустые гидрогели управления. С помощью стерильным шпателем, передавать каждый гидрогель в чистую 1,5 мл пробирку Эппендорфа и добавить 250 мкл три-реагента в каждую пробирку. Следуйте инструкциям производителя, чтобы изолировать РНК. После изоляции РНК и количественного использования 1 мкг этом из каждого образца и выполнить обратную транскрипцию в кДНК в использовании High Capacity кДНК обратной транскрипцией Kit. Для количественной ПЦР TaqMan использовать экспрессии генов массивов для изучения экспрессии генов ваших интересов. Нормализация уровни экспрессии гена GAPDH внутренне. Для условий ПЦР включают 2 мин инкубации при 50 ° С инактивировать предыдущие ампликонов с гликозилаз урацил-ДНК, с последующим 10-60; мин инкубации при 95 ° C, чтобы активировать полимеразы Taq. Затем выполните сорок циклов ПЦР, состоящий из 15 сек при 95 ° С и 1 мин при 60 ° С. 5. Биохимические анализы Для каждой ячейки-гидрогель конструкций количественно ДНК и сульфатированных гликозаминогликанов (сГАГ) производство как следовать. Тщательно аспирата СМИ и поставить стерильную PBS 1X на клетки-Ладена, а также пустые гидрогели управления. Взвесить пустую трубку и положить, что гидрогель внутрь после блоттинга его на папиросную бумагу и записывать вес или влажный вес гидрогелей. Замораживание каждый гидрогель при -20 ° С в отдельном 1,5 мл пробирку Эппендорфа на ферментативного расщепления, а затем использовать Аликвоту расщепленной продукта для запуска PicoGreen определения (ДНК) и диметил-метиленовый синий определения (GAG). Подготовка papainase решение для ферментативного расщепления гидрогелей. Сначала подготовьте буфер PBE путем взвешивания 7,1 г натрия Phosphatе двухосновной (Na 2 HPO 4) и 1,6 г этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевой соли (ЭДТА-Na 2). Растворить в 500 мл дН 2 O, доведения рН до 6,5 и фильтруют через очищенного раствора 0,22 мм фильтр. Растворите 0,035 г L-цистеина в 20 мл буфера PBE. Фильтр решение и 100 мкл стерильной фермента папаина. Когда все будет готово для выполнения анализов, принять трубы от -20 ° С и добавить 300 мкл готового раствора папаина в замороженных гидрогелей. Измельчите гель с помощью ступки и пестика и хорошо перемешать с пестиком двигателя. Довести объем до 500 мкл с дополнительной решения папаин. Выполните ту же процедуру для гелей управления. Инкубируют при 60 ° С в течение 16 ч 3,9. Поэтому раствор, содержащий переваренной гидрогель может использоваться для ДНК и GAG количественного. Измерьте содержание ДНК с использованием анализа PicoGreen с ДНК фага лямбда в качестве стандарта следующее пр производителяotocol. Количественно содержание сульфатированных-GAG с помощью 1,9-диметилметилен синий (DMMB) анализа связывания красителя с акулой хондроитинсульфат в качестве стандартного 10. Определяют содержание GAG путем деления количества ГАГ для соответствующего сырого веса. 6. Механические испытания Выполните испытаний на неограниченное сжатие, используя Инстрон 5944 тестирования системы впрыска с датчиком нагрузки 10 Н. После нужные дни культуры в пробирке, выполнить тест на сжатие клеток-гидрогель эшафот и межклеточных гидрогели управления. Погрузите образцы в ванне PBS при комнатной температуре и сжатие в размере 1% деформации / с до максимальной деформации 15% 11,12 после физиологической деформации, испытываемой хрящевой ткани под условия нагрузки, как сообщается, будет на 10-20% 13,14. Создать стресс против деформационных кривых и кривой посадки с использованием полиномиального уравнения третьего порядка. Определить COMPRщий касательного модуля из кривой уравнения подборки при значениях деформации 15%.

Representative Results

Биологически активные гидрогели, содержащие ПЭГ и CS фрагменты (рисунок 1) представляет собой идеальную платформу для культуры и созревания хондроцитов суставных 2,3,5,7 человека. Хондроцитов из разных возрастов и болезненных состояний можно культивировать с описанным способом и анализировали на их фенотип, экспрессии генов и биохимических и механических свойств хрящевой ткани, генерируемого. Три образца хондроцитов, ювенального 6 месяцев, взрослой жизни 34 лет и osteoarthritic- 74 лет, собирали через 3 недели культуры в 3D биомиметических гидрогелей. Экспрессия генов анализ нормальных хондроцитов, как несовершеннолетних и взрослых, показали увеличение экспрессии генов хондроцитов Col2a1 и Col6a1. Напротив, больные хондроциты показали резкое снижение Col2a1 сохраняя экспрессию Col6a1 (рисунок 2) показывает потерю хондрогенной фенотипа несмотря на то, культивируют в выгодном биомиметического среды. Гидрогели CS-PEG также служить в качестве динамичной среде для хондроциты размножаться, переварить уже существующие матрицу ПЭГ и CS и хранение их перицеллюлярный и внеклеточный матрикс, основные компоненты зрелого хрящевой ткани. Учитывая эти способности, расширение хондроцитов после 3 недель культуры в пробирке можно оценить путем количественного ДНК с красителем PicoGreen. Сравнительный анализ трех групп клеток показывают, что плотность клеток несовершеннолетних и взрослых групп населения не изменилась, а О.А. хондроциты демонстрировали резкое снижение по сравнению с 1-й день культуры. Потеря содержания ДНК наблюдалось также для ОА, но не других хондроцитов, предлагая возможные гибель клеток во время долгосрочного культуры (рис 3). Секретируемый матрицы количественно как содержание сульфатированного GAG с красителем Анализ связывания DMMB на стадии конечной точки через 3 недели культуры. ГАГ содержание нормируется сырого веса гидрогеля как RecorДед до ферментативного расщепления и бесклеточной вклад вычитается. Как показано на рисунке 4, хондроциты хранение подобный значительное количество GAG в течение 3 недель культуры в 3D гидрогелей. Наличие физической помост позволяет оценить биомеханических свойств образцов через испытаний на неограниченное сжатие 2,3. В то время как бесклеточные гидрогели пройти уменьшение сжатия модулей, сотовые Ладена конструкции поддерживается сжимающие модули после 3 недель в культуре (рисунок 4). Фенотипический, биохимические и биомеханические анализы, описанные здесь, следовательно, полезны для оценки и понимания потенциала разных групп населения хондроцитов для инженерной хряща. Рисунок 1. ПЭГ-CS биомиметических гидрогели для 3D хондроцитов кульры. Хондроциты ресуспендировали в смеси, содержащей поли (этиленгликольдиакрилат) (PEGDA) и хондроитин сульфат-метакрилата (CS-МА) и приведением в заказ цилиндрической форму для геля. После УФ-облучения, затвердевает гели собраны из форм и жизнеспособность клеток оценивают по живой мертвой окрашивания 24 ч после инкапсуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. Экспрессия генов в хондрогенных хондроцитов человека, культивируемых в 3D биомиметических гидрогелей. Количественный экспрессию генов хряща маркеров Col2a1 и Col6a1 несовершеннолетними, взрослых и ОА хондроциты через 3 недели культуры в 3D биомиметических гидрогелей. Значения нормированы на уровне экспрессии генов в день 1. Ошибка бARS представляют среднее ± SD. р * <0,05, как определено по тестам двух Стьюдента. Измененный Smeriglio др. 2 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3. Содержание ДНК в человеческих хондроцитов, культивируемых в 3D биомиметических гидрогелей. Количественное определение ДНК с помощью анализа PicoGreen в отношении несовершеннолетних, взрослых и ОА хондроциты через 3 недели культуры в 3D биомиметических гидрогелей. Значения нормированы на уровне ДНК в день 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. <ш /> Рисунок 4. Измерение содержания ГАГ и неограниченный испытание на сжатие человеческих хондроцитов в 1 день и через 3 недели культуры в 3D биомиметических гидрогелей. (А) ГАГ количественное по DMMB анализа в хондроцитах на 1 день и через 3 недели культуры в 3D биомиметические гидрогели. Значения нормированы на влажный вес (WW) и выражается в мкг / г. (Б) при сжатии модуль (кПа) бесклеточной и клеточных нагруженные гидрогели на 1 день и через 3 недели культуры в 3D биомиметических гидрогелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенная версия этой фигуры.

Discussion

Как сообщалось, в этом протоколе, 3D гидрогели способны поддерживать фенотип хондроцитов в культуре, избегая процесса клеточной дифференцировке в клетки, как правило, волокнистый хрящ, с которыми сталкиваются с монослойных культур ^15. Кроме того, долгосрочные культурах chondrocytes- гидрогеля конструкции показали благоприятную среду, которая поддерживает функции клеток внутренние, связанные с возрастом и болезнями.

Использование 3D биомиметического гидрогеля имеет несколько преимуществ. Во-первых, включение сульфата хондроитина (CS), основным компонентом найти в суставного хряща, позволяют клеткам деградировать гидрогеля матрицу, пряча хондроитиназу и лег вновь синтезированной хряща внеклеточного матрикса ^{5, 16.} Кроме того, CS было показано чтобы иметь противовоспалительные свойства в артритом суставов. Биомиметический гидрогель можно также использовать в качестве материала для строительных лесов доставки клеток в восстановлении хрящей, а может быть химически модифицированычтобы облегчить ткани-биоматериал интеграции ^17,18.

Использование гидрогелей ПЭГ-CS позволяет долгосрочные культур хондроцитов и оценку биохимических и механическими свойствами. Здесь мы показываем, как эта платформа может быть полезным для сравнительных анализов различных источников дифференцированных хондроцитов, чтобы определить оптимальный тип клеток для машиностроения хряща. Интересно, что хондроциты, заключенные в гидрогели остаются жизнеспособными и размножаются в соответствии с их собственными способностями. Опоры гидрогелевой композиции, по сути, рост здоровых хондроцитов молодых и взрослых, как показано на рисунке 2. Состав и структура описанных гидрогелей также способствует формированию хрящевой ткани, как указано осаждения функционального внеклеточного матрикса, оцененной гликозаминогликанов (GAG ) количественное.

Дополнительным преимуществом является то, что хондроцитов-гидрогелевые конструкцииможет быть оценена по механическим свойствам новообразованной хрящевой ткани. Следует отметить, что испытание на сжатие неограниченном должны быть выполнены на бесклеточной гидрогеля для сравнения. В гидрогели, на самом деле, имеют характеристическую жесткость за счет жесткости фрагментов CS. Неограниченном деформации сжатия, 5-20% (при скорости деформации 1% / с) могут быть применены для механических испытаний хрящевой ткани ^11,12 после физиологической деформации, испытываемой хрящевой ткани под условия нагрузки, как сообщалось, 10-20 % ^13,14. Реакция и клеток-Ладена и межклеточных гидрогелей в механических испытаний оценивалась в культуральной конечной точки. В описанном выше примере мы наблюдали сравнимую жесткость содержащих конструкций взрослых и подростков хондроциты, в отличие от нижней жесткости конструкций, содержащих ОА хондроциты. Такие механические свойства клеток-гидрогеля конструкции позволяют оценивать функциональных свойствахформируется ткань дает углубленный анализ способности клеток созревания.

В заключение, использование 3D-биомиметические гидрогелей изучить потенциал различных популяций хондроцитов для генерации хрящевой ткани может широко применяться. Кроме того, исследования в пробирке, описанных здесь, трансплантация в естественных клеточных нагруженные конструкции могут быть предусмотрены для изучения клеток и созревание регенеративный потенциал в физиологическом контексте. Дальнейшие модификации гидрогеля платформы с дополнительными биомиметических факторов также может быть предусмотрено, чтобы оптимизировать пролиферацию хондроцитов и созревание.

Materials

juvenile chondrocytes (Clonetics™ Normal Human Chondrocyte Cell System )	Lonza	CC-2550
adult chondrocytes (Clonetics™ Normal Human Chondrocyte Cell System)	Lonza	CC-2550
poly(ethylene glycol diacrylate)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-1000-1g
2-morpholinoethanesulfonic acid	Sigma	M5287
photoinitiator	Irgacure	2959
sodium chloride	Sigma	S9888
chondroitin sulfate sodium salt	Sigma	C9819
N-hydroxysuccinimide	Sigma	130672
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride	Sigma	E1769
2-aminoethyl methacrylate	Sigma	516155
dialysis tubing	Spectrum Laboratories	132700
Collagenase 2	Worthington Biochemical	LS004177
Collagenase 4	Worthington Biochemical	LS004189
DMEM/F12 media	HyClone, Thermo Scientific	SH3002301
live/dead assay	Life Technologies	L3224
Tri reagent	Life Technologies	AM9738
Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Assay Kit	Invitrogen	P11496
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S3264
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt	Sigma	E5134
L-Cysteine	Sigma	C1276
1,9-dimethylmethylene blue	Sigma	341088
Instruments
UV light equipment – XX-15LW Bench Lamp, 365nm	UVP	95-0042-07
Instron 5944 testing system	Instron Corporation	E5940