Анализ<em> Yersinia энтероколитные</em> Эффектор Транслокация в клетки-хозяева с помощью Бета-лактамазы эффекторных Слияния
Summary
Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.
Abstract
Многие грамотрицательные бактерии, включая патогенную Yersinia SPP. Использовать тип III секреции систем транслоцироваться эффекторные белки в эукариотических клетках-мишенях. Внутри клетки-хозяина эффекторных белков в клеточных функций манипулирования в интересах бактерий. Чтобы лучше понять, контроль типа секреции III во время взаимодействия клетки-хозяина, чувствительный и точный анализов для измерения транслокации требуется. Мы здесь описывать применение в анализе на основе слияния фрагмента эффектор белка Yersinia энтероколитные (Yersinia белка наружной; YopE). ПЭМ-1 бета-лактамазы для количественного анализа транслокации Анализ опирается на расщеплении клетки проникающего FRET краситель (CCF4 / AM) по транслоцируется бета-лактамаз слияния. После расщепления ядра цефалоспоринов CCF4 по бета-лактамазы, FRET из кумарина с флуоресцеином нарушается и возбуждение кумарина фрагмента приводит к синей флуоресценции.Различные приложения этого метода были описаны в литературе подсветки его универсальность. Способ позволяет проводить анализ транслокации в пробирке, а также в в естественных условиях, например, в мышиной модели. Обнаружение сигналов флуоресценции можно проводить с использованием пластин читателей, анализ FACS или флуоресцентной микроскопии. В установке, описанной здесь, в пробирке транслокации эффекторных слитых клеток HeLa в различных мутантов по Yersinia контролируется лазерной сканирующей микроскопии. Запись внутриклеточного преобразования лада репортера по бета-лактамаз эффекторной слияния в режиме реального времени обеспечивает надежную количественные результаты. Мы здесь, показывают примерные данные, демонстрируя повышенную перемещение по Y. энтероколитные YopE мутант по сравнению с штаммом дикого типа.
Introduction
Типа III секреции системы специализированные белок-экспорт машины, используемые различным родам грамотрицательных бактерий непосредственно доставить бактериально закодированные эффекторные белки в эукариотические клетки-мишени. Хотя сам секреции техника высоко консервативен, специализированные наборы эффекторных белков развивались среди различных видов бактерий, чтобы манипулировать клеточные сигнальные пути и облегчают определенные бактериальные стратегии вирулентности 1. В случае Yersinia, до семи эффекторных белков, так называемых Yops (Yersinia внешние белки), которые перемещаются по клетки-хозяина контакта и действовать вместе, чтобы разрушить ответов иммунных клеток, таких как фагоцитоз и продукции цитокинов, т.е. разрешить внеклеточный выживаемость бактерий 2-4. Процесс транслокации строго контролируется на разных этапах 5. Установлено, что основным активации T3SS инициируется ее контакта с целевой CELL 6. Однако точный механизм этого возбуждения еще не выяснены. В Yersinia второй уровень так называемого тонкой настройки транслокации достигается вверх или вниз регулирующие деятельность клеточных Ро ГТФ-связывающих белков Rac1 или RHOA. Активация Rac1 например invasin или цитотоксический некротизирующий фактор (CNF Y-Y) приводит к увеличению транслокации 7-9, в то время GAP (ГТФ активации белка) функцию транслоцируется YopE вниз регулирует Rac1 деятельность и, соответственно, уменьшается перемещение отрицательной обратной связи типа механизма 10,11.
Допустимые и точные методы являются необходимым условием для расследования, как перемещение регулируется во Yersinia взаимодействия клетки-хозяина. Много различных систем были использованы для этой цели, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Некоторые подходы опираются на лизис инфицированных клеток, но не бактерий различными детергентами с последующим вестерн-блоттинга. Чте Общим недостатком этих методов является то, что незначительные, но неизбежно лизису бактерий потенциально загрязняет клеточного лизата с бактериями-связанные эффекторных белков. Однако обработка клеток протеиназой К деградировать внеклеточных белков эффекторные и последующего использования дигитонина селективного лизиса эукариотических клеток были предложены для минимизации этой проблемы 12. Важно отметить, что эти анализы в решающей зависит от высокого качества анти-эффекторных антител, которые в основном не в продаже. Попытки использовать поступательные слитые белки эффекторных и флуоресцентные белки, как GFP контролировать перемещение не увенчались успехом вероятно, связано с шаровидным третичной структуры флуоресцентных белков и неспособности секреции аппарата разворачиваться их перед секрецией 13. Тем не менее, несколько различных репортер теги, как СуА (кальмодулинзависимой аденилатциклазу) домен токсина Bordetella коклюша cyclolysin 14 или флэшТег были успешно использованы для анализа транслокации. В первом тесте ферментативная активность СуА используется для усиления сигнала внутриклеточного слитого белка, в то время как флэш-тега, очень короткий tetracysteine (4Cys) мотив тег, позволяет маркировки со вспышкой biarsenical красителя, не нарушая процесс секреции 15.
Подход применяется здесь сообщалось, впервые с Charpentier др., И основана на внутриклеточного превращения красителя CCF4 Фёрстера резонансной энергии передачи (FRET) по перемещаются эффектор ТЕМ-1 бета-лактамазы слитых 16 (фиг.1А). CCF4 / АМ представляет собой клетку проникающий соединение, в котором производное кумарина (донор) и флуоресцеин фрагмент (акцептор) связаны сердечника цефалоспоринов. При пассивном вступления в эукариотической клетке, не-флуоресцентного этерифицированный CCF4 / АМ соединение обрабатывается сотовой эстераз в заряженном и флуоресцентного CCF4 и тем самым в ловушкев клетке. Возбуждение кумаринового фрагмента при 405 нм приводит к FRET флуоресцеина фрагмента, который испускает зеленую сигнала флуоресценции при 530 нм. После расщепления ядра цефалоспоринов по бета-лактамаз FRET нарушается и возбуждение кумарина фрагмента приводит к синей флуоресценции at460 нм. Различные приложения этого метода были описаны в литературе подсветки его универсальность. Способ позволяет проводить анализ транслокации в пробирке, а также в в естественных условиях, например, метод был использован в качестве модели инфекции мыши, чтобы определить популяции лейкоцитов, предназначенные для транслокации в естественных 17-19. Считывание сигналов может быть проведено с использованием пластин читателей, анализ FACS или флуоресцентной микроскопии. Следует отметить, что метод также дает возможность контролировать перемещение в в режиме реального времени по живых клеток микроскопии в течение инфекционного процесса 20,21. Вот флуоресценции лазерной сканирующей микроскопии был применен для readouт флуоресцентных сигналов, поскольку она обеспечивает высокую чувствительность и точность. В частности, способность регулировать окно излучения с нанометровым точностью в сочетании с высокой чувствительных детекторов облегчает оптимизированный обнаружение флуоресценции и свернутое перекрестных помех. Кроме того, это настройка микроскопии могут быть адаптированы для мониторинга в режиме реального времени транслокации и потенциально позволяет для одновременного анализа хозяин-патоген взаимодействия на клеточном уровне.
В этом исследовании ставок транслокации У. энтероколитные штамм дикого типа и мутанта YopE удаление демонстрируя hypertranslocator фенотип 10,11 были образцово проанализированы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы здесь успешно применяется на основе анализа ПЭМ-1 бета-лактамаз репортер для количественного анализа эффекторных транслокации по Y. энтероколитные. Много различных вариантов этой чувствительной, конкретной и относительно простой методики были описаны в литературе. В этом иссл…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Antonio Virgilio Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.
Materials
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
Referenzen
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
- Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
- Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia’s stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
- Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
- Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
- Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).
- Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
- Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).
- Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
- Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
- Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
- Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
- Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
- Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
- Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).
- Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).
- Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
- Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
- Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
- Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).
