JoVE Journal > Immunology and Infection
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Immunologie und Infektion

Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS

Published: July 11, 2016
doi:
10.3791/53176
, , ,
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus,TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus,TU Dresden

Summary

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Abstract

Há um certo número de agentes patogénicos bacterianos raras e, por conseguinte, suficientemente descritas, que são relatados para causar infecções graves, especialmente em pacientes imunocomprometidos. Na maioria dos casos, apenas alguns dados, em sua maioria publicados como relatos de casos, estão disponíveis que investigar o papel desses agentes patogênicos que um agente infeccioso. Por conseguinte, a fim de clarificar o carácter patogénico dos referidos microorganismos, é necessário levar a cabo estudos epidemiológicos os quais incluem um grande número dessas bactérias. Os métodos utilizados em tal estudo de vigilância tem que seguir os seguintes critérios: a identificação das estirpes tem que ser precisos de acordo com a nomenclatura válida, devem ser fácil de manusear (robustez), econômico em diagnósticos de rotina e eles têm para gerar comparáveis resultados entre diferentes laboratórios. De um modo geral, existem três estratégias para a identificação de estirpes bacterianas num local de rotina: 1) identificação fenotípica caracterizar o Biochemical e metabólicas propriedades das bactérias, 2) técnicas moleculares como a sequenciação do gene 16S rRNA e 3) espectrometria de massa como uma abordagem baseada em romance proteoma. Uma vez que a espectrometria de massa e abordagens moleculares são as ferramentas mais promissores para a identificação de uma grande variedade de espécies bacterianas, são descritos estes dois métodos. Avanços, limitações e potenciais problemas ao utilizar estas técnicas são discutidas.

Introduction

identificação segura de agentes patogénicos raros em diagnósticos de rotina é dificultada pelo fato de que os métodos culturais e bioquímicos clássicos são complicados e, por vezes questionável. Além disso, um laboratório de diagnóstico microbiologia tem de processar um grande número de agentes patogénicos, que vão desde algumas centenas a vários milhares, diariamente, o que requer o uso de sistemas automatizados. Em adição à gestão de um alto rendimento diária, é necessária a identificação precisa de espécies bacterianas. Isso se justifica, uma vez que diferem em seu padrão de susceptibilidade antimicrobiana e identificação, portanto, correta fornece o clínico com informações essenciais para escolher antibióticos apropriados (por exemplo, Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43.

sistemas de identificação microbiana automatizados (AMIS) aplicar conjuntos padronizados de reações enzimáticas para caracterizar as propriedades metabólicas de isolados bacterianos <sup> 13,15,16,26,27. Embora os cartuchos utilizados nestes sistemas utilizam um grande número de diferentes reacções bioquímicas, por exemplo, 47 na placa de GN da amis utilizado neste estudo 52, esta estratégia permite a identificação segura apenas para um conjunto limitado de bactérias. Além disso, o banco de dados, um sistema especialista avançado, está claramente centrado na detecção de bactérias relevantes e altamente relevantes de importância médica 13,15,16,36. Dois outros sistemas, amplamente utilizado em laboratórios, também se aplicam esta abordagem bioquímica para a identificação de bactérias. Estudos recentes demonstram uma precisão de identificação comparáveis ​​entre os Amis utilizados neste estudo e um dos concorrentes (93,7% e 93,0%, respectivamente), enquanto que o 3º Amis tem uma precisão de apenas 82,4% de identificação em nível de espécie 35. Tais discrepâncias podem ser explicadas pela qualidade das referências de dados de identificação subjacentes, as versões de kits e software, diferenças em metabolismo e competência do pessoal técnico 35,36.

Dois sistemas de MALDI-TOF MS automatizado (sistema de identificação microbiana MALDI-TOF, IHMs) são usados ​​principalmente. Estes sistemas permitem a detecção de um grande número de espécies bacterianas com base no seu espectro de massa de proteína de impressões digitais. Por exemplo, a base de dados dos MMIs utilizadas contém 6000 espectros de referência. Sistemas de identificação baseados em espectrometria de massa oferecem detecção rápida e confiável de uma grande variedade de microorganismos, incluindo raros patógenos 11,48,51. Até à data apenas algumas comparações diretas estão disponíveis entre as MMIs utilizados neste estudo e sua concorrente 19,33. De acordo com Daek et al., Ambos os sistemas fornecem uma elevada taxa de precisão semelhante a identificação, mas os MMIs utilizados neste estudo parece ser mais fiável na identificação de espécies 19.

genes distintos Do mesmo modo, técnicas de biologia molecular endereçamento bem conservados mas também ( <em> por exemplo, 16S rDNA ou rpoB) permitir a identificação das espécies clara 3,22,61. Entre estes, o 16S ADNr é o gene de manutenção mais amplamente utilizado devido à sua presença em todas as bactérias 34. Sua função permanece inalterada e, finalmente, com cerca de 1.500 pb, é longo o suficiente para ser adequado para bio-informática 14,34. Muitos pesquisadores consideram análise do gene 16S rRNA como o "padrão-ouro" para a identificação bacteriana 21. Isto é devido ao facto de alguns laboratórios utilizam técnicas de hibridação DNA-DNA até à data para a identificação de bactérias raros ou novos 14,34. Além disso, mais e mais bases de dados estão disponíveis, que podem ser utilizados para análise do gene 16S rRNA 50. No entanto, tem que ser tomado em conta que os sistemas de detecção à base de ADNr 16S tem uma sensibilidade limitada em comparação com protocolos de PCR convencionais. Além disso, a abordagem molecular é sofisticado, consumindo tempo e requer pessoal altamente treinado, bem comodedicados instalações laboratoriais e é, portanto, não é facilmente implementado em diagnósticos de rotina 55. Além disso, tem sido demonstrado que a combinação de, pelo menos, dois métodos diferentes para a identificação de bactérias conduz a identificação da estirpe de elevada precisão. A combinação de MALDI-TOF MS e sequenciação de 16S ADNr permite a identificação de um grande número de diferentes espécies bacterianas com alta precisão. Recentemente, a combinação de análise genética MALDI-TOF MS e 16S rRNA foi apresentada para a identificação de bactérias estudar questões epidemiológicas e agentes patogénicos raros 56.

Protocol

1. Extracção de DNA bacteriano Preparação de solução de PBS Pesar 1,65 g de Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g de NaH 2 PO 4 x 2H 2 O e 8,80 g de NaCl, num balão e encher com água destilada para um volume final de 1000 ml. Ajustar o pH para 7,4. Para utilização final filtrar a solução através de uma bactéria-proof (0,22) filtro. Bactérias Extracção de DNA de bactérias Gram-negativas Streak o mate…

Representative Results

MALDI-TOF MS é um método rápido e barato para diagnósticos de rotina microbiológicos romance,. Identificação de espécies bacterianas por MALDI-TOF MS produz espectros composta principalmente de proteínas ribossomais, mas também outras "proteínas muito conservadas com funções casa de manutenção afetados o menos possível e por condições ambientais" 17 banco de dados .A deste MMIs contém um grande conjunto de espectros de referência e até mesmo bact…

Discussion

Ambos MALDI-TOF MS e 16S rRNA sequenciação genética oferecem a possibilidade de identificar um grande número de diferentes bactérias. MALDI-TOF MS é um método rápido e barato, o que é fácil de manusear e de grandes bases de dados de espectros de massa bacteriana estão disponíveis. Por esta razão, MALDI-TOF MS é um custo método rápido, eficaz e de confiança para realizar os estudos de rastreio focados em agentes patogénicos bacterianos raras 17,20,39,51. Em um estudo prospectivo comparando MA…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Prof. Enno Jacobs for his continuing support.

Materials

CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating Homogenizer
Glass-beads 1,0mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net GmbH, Ulm, Germany  –
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net GmbH, Ulm, Germany  –
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany -  Thermocylcer
Reaction tube 1.5 mL SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 mL SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany – Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
(2 x 500 g)
SmartLadder SF – 100 to 1000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromphenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany –
Ethidium bromide solution 1 %(10 mL) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany – Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10 x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 mL) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany – Sequenzer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 mL Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany –
microflex (the MALDI TOF MS maschine) Bruker Daltonik, Bremen, Germany –
MALDI Biotyper (the MALDI TOF MS system) Bruker Daltonik, Bremen, Germany – our mMIS
VITEK MS  bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMis 
flexControl 3.4 (control software) Bruker Daltonik, Bremen, Germany –
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC), (analysis software) Bruker Daltonik, Bremen, Germany –
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqgreen  peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007 
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  our aMis 
MicroScan  Beckman Coulter  2nd aMis 
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD 3rd aMis 
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) ATCC  postive control for PCR 
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Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).
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