Vasküler Hücre Remodeling Soruşturma Fizyolojik in vitro Modeli ve Uygulaması ile Patolojik Kan Akış
Summary
Bu protokol, hastalık patolojilerinde hücre yanıtını belirlenmesinde yardımcı olmak için, in vitro olarak fizyolojik veya patolojik kan akışını çoğaltır. Kan pompası alt bölmeyi sönümleme bir basınç katılmasıyla, damar boyunca kan akımı değinmeyecek edilebilir ve vasküler endotelyum, ya da taklit eden ko-kültür, bir tek tabaka üzerine koydu.
Abstract
Vasküler hastalık Amerika Birleşik Devletleri içinde ölüm yaygın bir nedenidir. Bu yazıda, damar hastalığı patolojileri doğru akış dinamikleri katkısını incelemek için bir yöntem mevcut. Duvar sertleşme, yara izi veya tüm sıvı akış oranlarını etkileyebilir kısmi stenoz ve pulsatil akım büyüklüğü, ya da pulsatilite indeksi ile sıklıkla Sağlıksız arterler. Çeşitli akış koşullarının çoğaltma kan pompasının alt bölmeyi sönümleme akış basıncını ayarlama sonucudur. Sıkıştırılabilir ortamı pompasından pulsatil basıncı emmek ve bu nedenle pulsatilite indeksi değişir için kapalı bir akış sistemi içinde hava giriş sağlar. Burada açıklanan yöntemi sadece çok kontrollü giriş ve kolayca ölçülebilir sonuçlar, yeniden üretilir. Bazı sınırlamalar ancak sistem tarafından yaklaşılır karmaşık fizyolojik nabız dalga, rekreasyon vardır. Endotel hücreleri, düz kas hücreleri, fibroblastlar, kan akışı ve thr etkilenirarteri ough. Kan akımının dinamik bileşen kalp debisi ve arter duvarı uyumu ile belirlenir. Akış dinamikleri vasküler hücre mekano-transdüksiyon sitokin salınmasını ve arter içinde hücre tipleri arasında çapraz-tetikleyebilir. Vasküler hücrelerde ko-kültür damar duvarında ve mekanik sinyal vasküler tepkisi üzerinde daha doğru bir resim yansıtan hücre-hücre etkileşim. Akışın dinamik ve ortalama (ya da sabit) bileşenlerine hücre tepkisinin de dahil olmak üzere akış dinamikleri, katkısı, bu nedenle hastalığın patoloji ve tedavi etkinliğini belirleyen önemli bir ölçümdür. Bir in vitro ko-kültür yerine getirilmiştir ve basınç simüle kardiyak çıktı üretir kan pompası alt süspansiyon ile, çeşitli patolojiler arter hastalığı araştırılabilir.
Introduction
Kardiyovasküler hastalıklar için morbidite oranları birçok sağlıksız damar sonuçlanan, Amerika'daki en büyük bulunmaktadır. Sağlıklı arterler bir endotel hücre (AK) tek tabaka ile kaplanmış yumuşak lümen yüzeyi ile, elastik doku oluşur. Arter akışı pozitif ortalama debi ile salınan bir dalga fonksiyonu olarak modellenmiştir olabilir. Pulsatilite indeksi (PI) salınım büyüklüğü bölüm ve ortalama debi (.. PI = (Max – Min) / Ortalama) ise, 1 ve değişken damar elastikiyeti ile in vitro modellenmiştir 2 Arter elastikiyet akışının depolanması önemlidir. Kalp kasılmaları enerji, sistolik basınç altında dilate ve kan akımı PI modüle önemli bir rol oynamaktadır. Kalp tutarlı olarak, belirli aralıklarla, hacimsel akışı muhafaza için, arteryel genleşme akım hızı, kesme stresi ve PI azaltarak akış stabilitesinin arttırılması, enine kesit alanını arttırmaktadır. Elastikiyet Sıklıkla sağlıksız arterler mevcut değişikliklerya da uyum vasküler yeniden, skar dokusu veya kireçlenme 3, 4 sertleşme görüntüleniyor. Ek olarak, neointimal hiperplazi (NIH), 5 anevrizma ve hipertansiyon 6 ve vasküler fibrozların 4 gibi diğer damar hastalıkları, damar çapı daraltır olabilir. Ancak, mevcut ilaç tedavisi ve damar hastalıkları cihaz tedavisi genellikle sık sık damar morfolojisi ve özelliklerinde değişiklikler karmaşık bir damar hastalığında damar duvarı uyum veya kan akış dinamikleri önemini ihmal. Ne balon anjiyoplasti stent ne duvar elastisite 7 komplikasyon cevap. Bu nedenle, kan in vitro model arter hastalığı ve işlemlerin sonucu olan akımlarının hastalığı patolojileri ve tedavisinde gelecek etkisini araştıran önemlidir. Burada, damar hastalığı Pathol hücre yanıtını belirlemek için tasarlanmıştır fizyolojik ve patolojik kan akışını kopyalayan bir yöntem tariftakımının kontrolü. Sıvı akışı damar tüm hücreleri etkileyen damar sağlığında önemli bir mekanik sinyal olan damar duvarının kayma strese neden olur. Sıvı kesme için vasküler endotel üzerinde çeşitli mekanik algılayıcılar endotel 8 mechanosensing için son çalışmalarda gösterilmiştir birincil cilium dahil, tespit edilmiştir. Endotel hücre aktivitesi ve morfolojisi akış hızı, yönü ve pulsatilitesini etkilenir. Ek olarak, yumuşak kas hücresi (SMC) göçü interstisyel sıvı ile 9 arasındaki düşük hızlı akış mekano-sinyaller etkilenebilir ve akış ve sitokin ile akış sinyallerinin mekano-transdüksiyon için kendi yanıt verme yoluyla endotel hücrelerinden parakrin sinyali yoluyla olabilir 10 yayınlayacak. Ortalama kesme, PI ve parakrin sinyal iletiminin "dozu" bağımlılık da birbirine olabilir. Tek tabakalı kültürü bu amaçla, çeşitli "doz" ile sıvı kesmeye vasküler hücre yanıtının belirlenmesi içinya da in vitro ko-kültür vasküler yeniden içine mekanistik anlayış sağlamak ve hastalık ve tedavi tahmini artırabilirsiniz. Bu deneyde kullanılan akış sistemi, bir kan pompası, bir yukarı akış sönümleme hava haznesi sadece deney düzeneği, bir alt hücre kültürü, paralel plaka akış odası ve ortam haznesi sırasında kullanılan bir alt-akış ölçer oluşur. Akış hızı anlamına gibi damar akım değişkenlerin kontrol dakikadaki vuruş ve PI kontrol akış hızı, darbe frekans ve basıncının esas olarak söndürme yoluyla elde edilebilir. Pulsatif kan pompalar hacimsel akış hızı ve nabız frekansı ortalama doğrudan ilgili, kontrollü inme frekansında, değişken strok deplasman mevcuttur. Akım devresi içinde bir hava rezervuarının giriş akışı salınım büyüklüğünü azaltarak, basınç sönümleme sağlar. Sönümleme odasının içindeki hava olması akış dalga aşırı basınç sağlayan, sıkıştırılabilir ise medya, sıkışmaz bir sıvıdırHava sıkıştırma tarafından emilir. Medya oranı hava çok damping nasıl oluştuğu üzerinde kontrol sağlar. Genişliğinde 50 mm uzunluğunda 75 mm Özel bir hücre kültürü akış odası akrilik oluşturuldu. Akış giriş deliğinden girer, ve akış odasının tamamen tutarlı akış sağlayan, giriş manifoldu boyunca genişler. Benzer akışı ve yapılar odası çıkışında bulunmaktadır. Hücreler, işlevselleştirilmiş slaytlar üzerine ekilmiş ve daha sonra akış odasına bağlıdır. Bu kolayca çalışma sonrasında alınan büyük nüfus için izin verir. Ortak kültür deneyleri sitokin / akım taşıma izin verirken kültürleri arasında, hücre-hücre teması ortadan kaldırmak için, gözenekli bir polikarbonat membran kullanılabilir. Bu sistem daha önce yüksek PI akışı ve endotel tek tabaka kültürü ve EC / SMC ko-kültür 1, 10 üzerindeki etkisini modellemek için hücre yanıtı için patolojik yüksek PI hastalığı araştırmak için kullanılır olmuştur. Bu akış con modellemek için kullanılan protokol anlataraketkiler cihazın, biz yanıtı hücre akım sinyali katkısını belirlemek başkalarına yardım etmek istiyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, in vitro pulsatil akışını taklit için bir yöntem tarif etmektedir ve hastalık patolojilerinde akış koşullarının etkilerini belirlenmesinde etkili ilk adım olabilir. Bu protokolü kullanarak önceki çalışmalar, bu protokol deneyimli laboratuarlar için tasarlanmıştır, akış koşullarının Ayrıca vasküler inflamatuar yanıt. 1, 10 katkıda bulunmuştur. Bunun gibi, ne de derinliği akışkanlar mekaniği, ne de biyokimyasal analizi tarif edilmektedir. Daha g…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar (WT HL097246 ve HL119371) AHA (WT 13GRNT16990019) ve NHLBI dahil finansman kaynakları, kabul etmek istiyoruz.
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)trethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70mm x 50mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/mL) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
Referenzen
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -. H., Huang, X. -. Q., Tan, H. -. M. Vascular fibrosis in atherosclerosis. Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients.. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
