Este protocolo replica o fluxo sanguíneo fisiológico ou patológico in vitro para auxiliar na determinação da resposta celular em patologias de doenças. Com a introdução de uma pressão da câmara a jusante de uma bomba de sangue de amortecimento, o fluxo de sangue em toda a vasculatura pode ser recapitulada e que incide sobre uma monocamada de endotélio vascular ou de uma co-cultura mimética.
A doença vascular é uma causa comum de morte nos Estados Unidos. Aqui, apresentamos um método para examinar a contribuição da dinâmica de fluxo em direção patologias doença vascular. Artérias saudáveis apresentam frequentemente enrijecimento da parede, cicatrizes, ou estenose parcial que pode afetar as taxas de fluxo de fluido, e a magnitude do fluxo pulsátil, ou índice de pulsatilidade. Replicação de várias condições de fluxo é o resultado de uma pressão de ajuste de fluxo a jusante da câmara de uma bomba de sangue de amortecimento. A introdução de ar dentro de um sistema fechado permite que o fluxo de um meio compressível para amortecer a pressão pulsátil da bomba, e, por conseguinte, variar o índice de pulsatilidade. O método descrito aqui é simplesmente reproduzidas, com entrada altamente controlável, e os resultados facilmente mensuráveis. Algumas limitações são recriação da forma de onda de pulso fisiológico complexo, o que só é aproximado pelo sistema. As células endoteliais, células musculares lisas, fibroblastos e são afectados pelo fluxo de sangue thrOugh da artéria. A componente dinâmica de fluxo de sangue é determinada através da saída da parede arterial e complacência cardíaca. Vascular célula mecano-transdução de dinâmica de fluxo pode desencadear a liberação de citocinas e cross-talk entre tipos celulares dentro da artéria. Co-cultura de células vasculares é uma interacção mais preciso célula-célula imagem de reflexão sobre a parede do vaso sanguíneo e a resposta vascular à sinalização mecânica. Contribuição de dinâmica de fluxo, incluindo a resposta celular aos componentes dinâmicos e médios (ou equilíbrio) de fluxo, é, por conseguinte, uma métrica importante na determinação da patologia da doença e da eficácia do tratamento. Através da introdução de um modelo de co-cultura in vitro e pressão de amortecimento a jusante da bomba de sangue que produz o débito cardíaco simulado, diversas patologias de doença arterial podem ser investigadas.
Taxas de morbidade para doenças cardiovasculares são a maior da América, com muitos resultante da vasculatura insalubre. As artérias saudáveis consistem em tecido elástico, com a superfície luminal macia revestida com uma monocamada de células endoteliais (CE). Fluxo arterial pode ser modelado como uma função de onda oscilante com taxa média de fluxo positivo. O índice de pulsatilidade (PI) é o quociente de oscilação magnitude ea média de fluxo (PI = (Max. – Min.) / Média), 1 e foi modelado in vitro com a elasticidade dos vasos variável 2 Arterial elasticidade é importante no armazenamento do fluxo. energia a partir de contracções do coração, dilatando sob pressão sistólica, e desempenha um papel importante na modulação PI do fluxo sanguíneo. Porque o coração mantém um consistente, pulsátil, fluxo volumétrico, a expansão arterial aumenta a área de corte transversal, o reforço da estabilidade do fluxo, reduzindo a velocidade do fluxo, tensão de cisalhamento e PI. Freqüentemente, as artérias saudáveis apresentam alterações a elasticidadeou de conformidade, exibindo enrijecimento de remodelação vascular, tecido cicatricial ou calcificação 3, 4. Além disso, outros distúrbios vasculares, tais como a hiperplasia neointimal (NIH), aneurisma 5 e 6 e hipertensão vascular fibrose 4, pode contrair o diâmetro dos vasos. No entanto, o tratamento medicamentoso atual e tratamento de doenças vasculares dispositivo muitas vezes negligenciar a importância da dinâmica de conformidade da parede do vaso ou do fluxo sanguíneo na doença vascular que é muitas vezes complicada por alterações na morfologia navio e propriedades. Nem a angioplastia com balão, nem implante de stent responder a complicação da parede elasticidade 7. Portanto, in vitro modelagem de fluxos de sangue resultante de doença arterial e tratamentos é importante na investigação de doenças e patologias futuro eficácia do tratamento. Aqui, nós descrevemos um método de replicar o fluxo sanguíneo fisiológico e patológico concebido para determinar a resposta de células na doença vascular Patholgias. O fluxo do fluido faz com que a tensão de cisalhamento na parede do vaso, que é um sinal mecânico importante na saúde dos vasos, que afecta todas as células no interior da vasculatura. Vários sensores mecânicos sobre o endotélio vascular de cisalhamento de fluidos, foram identificados, incluindo cílio primário mostrado em estudos recentes para endotelial mechanosensing 8. A atividade das células endoteliais e morfologia são afetadas pela velocidade de fluxo, direção e pulsatilidade. Além disso, células do músculo liso (SMC) migração pode ser afectada por Mecano-sinais de baixa velocidade de fluxo através do fluido intersticial 9, e pode também ser através da sinalização parácrina a partir de células endoteliais através da sua resposta ao fluxo e mecano-transdução de sinais de fluxo através de citocina liberar 10. A "dose" dependência de cisalhamento média, PI, e sinalização parácrina também podem ser interdependentes. Para este fim, a determinação da resposta vascular à célula de cisalhamento de fluidos com "dosagem" variada em cultura em monocamadaou co-cultura in vitro poderiam fornecer insights mecanicistas em remodelação vascular e melhorar a doença e previsão de tratamento. O sistema de fluxo utilizado neste experimento consiste em uma bomba de sangue, um fluxo de amortecimento reservatório de ar a montante, um medidor de vazão a jusante apenas utilizado durante a configuração experimental, uma cultura de células a jusante, de placas paralelas câmara de fluxo, e media reservatório. Controle de variáveis de fluxo vascular, tais como vazão média, batidas por minuto, e PI pode ser alcançada através do controlo do caudal, frequência de pulso, e introdução de pressão de amortecimento. Bombas de sangue pulsátil estão disponíveis com deslocamento variável acidente vascular cerebral, acidente vascular cerebral na freqüência controlada, directamente relacionadas com a taxa média de fluxo volumétrico, e frequência de pulso. Introdução de um reservatório de ar no interior do circuito de escoamento permite amortecimento de pressão, reduzindo a oscilação do fluxo de magnitude. Media é um fluido incompressível, enquanto o ar dentro da câmara de amortecimento é compressível, permitindo que o excesso de pressão a partir da onda de fluxo para serabsorvida pela compressão de ar. O ar à relação da mídia permite o controle sobre a forma como ocorre muito amortecimento. Um costume cultura de célula de fluxo câmara de 75 mm de comprimento por 50 mm de largura foi criado a partir de acrílico. Fluxo entra através da porta de entrada, e expande-se através do colector de entrada, fornecendo um fluxo consistente entre os elementos da câmara de escoamento. Fluxo e estruturas semelhantes estão presentes na saída da câmara. As células são semeadas em lâminas de funcionalizados, e subsequentemente ligados à câmara de fluxo. Isto permite uma grande população, facilmente recuperados após o estudo. Experiências de co-cultura pode utilizar uma membrana porosa de policarbonato para eliminar o contacto célula-a-célula entre as culturas, permitindo o transporte de citocina / fluxo. Este sistema foi anteriormente usado para modelar um elevado caudal de PI e o seu efeito sobre a cultura monocamada endotelial e CE / SMC co-cultura 1, 10, para investigar a resposta celular à doença patologicamente elevada PI. Ao descrever o protocolo usado para modelar estes fluxo concondições, esperamos ajudar os outros para cálculo da contribuição de sinal para a célula de fluxo de resposta.
Este protocolo descreve um método de reprodução de fluxo pulsátil in vitro, e pode ser o primeiro passo fundamental para determinar a contribuição de condições de fluxo para patologias de doenças. Estudos anteriores, usando este protocolo ter encontrado condições de fluxo de contribuir para a resposta inflamatória vascular. 1, 10 Além disso, este protocolo destina-se a laboratórios experientes. Como tal, nem em profundidade mecânica dos fluidos, nem análise bioquímica é aqui descrit…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de reconhecer as fontes de financiamento, incluindo a AHA (13GRNT16990019 para WT) e NHLBI (HL097246 e HL119371 para WT).
Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
(3-Aminopropyl)trethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
Glass Slide (70mm x 50mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
Fibronectin (25 μg/mL) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber |
Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |