Un metodo ottimizzato per l'isolamento ed espansione invariante Natural Killer cellule T da Spleen mouse
Summary
Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.
Abstract
La capacità di secernere rapidamente citochine dopo stimolazione è una caratteristica funzionale del invariante natural killer T (iNKT) linea cellulare. iNKT cellule sono quindi caratterizzati da una popolazione di cellule T innata capace di attivare e sterzo adattivo risposte immunitarie. Lo sviluppo di tecniche migliorate per la coltura e l'espansione di cellule murine iNKT facilita lo studio della biologia cellulare iNKT in vitro ed in sistemi modello in vivo. Qui si descrive un procedimento ottimizzato per l'isolamento e l'espansione di cellule spleniche iNKT murine.
Milza di topi C57BL / 6 vengono rimossi, sezionati e tese e la sospensione cellulare risultante è stratificato su supporti gradiente di densità. Dopo la centrifugazione, le cellule mononucleate spleniche (MNC) sono raccolti e CD5 positivi (CD5 +) linfociti sono arricchiti per l'utilizzo di sfere magnetiche. cellule iNKT all'interno della frazione CD5 + sono successivamente colorate con ^5; GalCer-caricato CD1d tetramero e purificata mediante la fluorescenza delle cellule attivate (FACS). FACS ordinati cellule iNKT sono quindi inizialmente coltivate in vitro utilizzando una combinazione di citochine ricombinanti murine e recettore delle cellule T piastriforme bound (TCR) stimoli prima di essere espanso in presenza di IL-7 murina ricombinante. Utilizzando questa tecnica, di circa 10 8 cellule iNKT possono essere generati entro 18-20 giorni di coltura, dopo di che possono essere utilizzate per saggi funzionali in vitro o in vivo per esperimenti di trasferimento nei topi.
Introduction
Murino invarianti natural killer T (iNKT), le cellule sono una popolazione distinta di linfociti T innate selezionati nel timo by-CD1d esprimendo timociti corticali 1,2. iNKT cellule esprimono un recettore delle cellule T (TCR) costituito da una catena invariante Vα14-Jα18 TCR accoppiato con entrambi Vβ8, Vβ7 o Vβ2 TCR 3, che è in grado di riconoscere endogena così come antigeni estranei lipidi nel contesto CD1d. Per esempio, le cellule murine iNKT riconoscono e sono attivati da un antigene chiamato isoglobotrihexosylceramide lipidica endogena (iGb3) 4, nonché α-galactosylceramide (αGalCer) 5,6, un glicolipide isolato da spugne marine. TCR-dipendente attivazione delle cellule iNKT promuove il priming delle risposte immunitarie adattative, e come risultato, le cellule iNKT hanno dimostrato di essere funzionalmente coinvolti nel miglioramento o lo sviluppo di una serie di patologie comprese malattia reumatica 7 e cancro <sup> 8. Attualmente, ligandi di cellule iNKT sintetiche costituiscono promettenti nuovi coadiuvanti che possono essere in grado di regolare una serie di condizioni immunopatologiche.
È stato precedentemente dimostrato che le cellule iNKT possono essere generati in vitro dopo isolamento dal tessuto del mouse tuttavia; molti di questi studi impiegano l'uso di cellule primarie presentanti l'antigene (APC) e / o linee cellulari 9, Vα14 TCR transgenici (Tg) topi 10, timomi o per la generazione di cellule derivate iNKT ibridomi 11,12. Inoltre, un gran numero di topi, elevati volumi di reagenti, quali dimeri CD1d αGalCer-caricati, e tempi lunghi di cultura fanno alcuni protocolli pubblicati meno eticamente ed economicamente accattivante 9,13.
In questo rapporto si descrive un metodo adatto per l'isolamento e l'espansione delle cellule iNKT vitro da topo milza. Più specificamente, il protocollo descrive un metodoper arricchire le cellule iNKT da milza del mouse che riduce i topi, i reagenti e il tempo richiesto per l'ordinamento delle cellule FACS, e propone un approccio ottimizzato per espandere le cellule iNKT milza ordinati in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici nel protocollo corrente comprendono l'isolamento e successivo arricchimento di linfociti CD5 + (Sezione 1 e 2), FACS ordinamento (sezione 3) e il fasciame iniziale di cellule iNKT (sezione 4). Dei provvedimenti nella Sezione 1, ricordarsi di strato con attenzione la sospensione cellulare milza nel medio gradiente di densità tale che un interfasica cellulare distinta viene generato dopo la centrifugazione. La successiva arricchimento per CD5 + linfociti di separazione cellulare…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.
Materials
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ – free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
Referenzen
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