باستخدام<em> السابقين فيفو</em> الثقافات تستقيم القطرة من الجامعة الجنين هيئات لدراسة العمليات التنموية خلال الماوس توالد
Summary
The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.
Abstract
التحقيق توالد في الرحم هي عملية صعبة من الناحية التقنية في الثدييات المشيمية نظرا لعدم إمكانية الوصول إلى الكواشف إلى الأجنة التي تتطور داخل الرحم. يوفر خارج الحي تستقيم طريقة الثقافة قطرة وضعت حديثا بديلا جذابا لالدراسات التي أجريت في الرحم. تقدم الثقافة فيفو السابقين قطرة القدرة على دراسة ومعالجة التفاعلات الخلوية ومسارات الإشارات المختلفة من خلال استخدام مختلف الحجب ومركبات تفعيل. بالإضافة إلى ذلك، فإن آثار مختلف الكواشف الدوائية على تطوير أجهزة معينة يمكن دراستها من دون آثار جانبية غير مرغوب فيها من إيصال الدواء النظامية في الرحم. بالمقارنة مع غيرها من نظم المختبر، وثقافة قطرة يسمح ليس فقط من أجل القدرة على دراسة ثلاثي الأبعاد التشكل وخلية خلية التفاعلات، التي لا يمكن استنساخها في خطوط خلايا الثدييات، ولكن يتطلب أيضا أقل بكثير صeagents من الآخر خارج الحي والبروتوكولات المختبر. توضح هذه الورقة السليم الماوس الجنين تشريح الجهاز وتقنيات زراعة قطرة تستقيم، تليها كله المناعي الجهاز لإثبات فعالية هذه الطريقة. فيفو السابقين قطرة طريقة ثقافة يسمح بتشكيل بنية الجهاز قابلة للمقارنة إلى ما لوحظ في الجسم الحي، ويمكن استخدامها لدراسة عمليات خلاف ذلك يصعب الدراسة بسبب الفتك الجنينية في النماذج في الجسم الحي. كنظام تطبيق النموذج، سيتم استخدام مثبط جزيء صغير للتحقيق في دور الأوعية الدموية في التشكل الخصية. هذا خارج الحي قطرة طريقة ثقافة غير قابلة للتوسيع إلى أجهزة الجسم الجنين أخرى، مثل الرئة وربما غيرها، على الرغم من أن كل جهاز يجب أن يكون على نطاق واسع درس لتحديد أي تعديلات الجهاز محددة لبروتوكول. ويوفر هذا النظام الثقافة الجهاز المرونة في التجريب مع أجهزة الجنين، والنتائج obtaineد باستخدام هذه التقنية ستساعد الباحثين اكتساب نظرة ثاقبة نمو الجنين.
Introduction
تجديد جهاز في الجسم الحي في البشر محدود للغاية؛ لذلك، هندسة الأنسجة، وتطوير الأنسجة والأعضاء من الخلايا الفردية التي تبرعت بها مجموعة، أصبح علاجا جذابا المحتملين لاستبدال الجهاز. ومع ذلك، لهذه الاستراتيجية العلاجية لتكون ناجحة، والعوامل والتفاعلات الخلوية العاملة في التشكل من الجهاز يجب دراستها بدقة وفهمها جيدا. نظرا لعدم القدرة على دراسة تطوير أجهزة معينة مع الأساليب التقليدية، تحولت الباحثون إلى الجنين كله بديل أو الثقافات الجهاز كله. Kalaskar وآخرون. 1 أظهرت أن ثقافة مرحلة التطور الجنيني كلها خارج الحي تعطي نتائج مماثلة (في 58٪ من الأجنة مثقف) لفي التنمية الرحم، مما يشير إلى أن وسائل الثقافة فيفو السابقين هي بديل ممكن للدراسات توالد.
نظام الجهاز ثقافة فردية، مثل هذا خارج الحي دروPLET نظام الثقافة، ويسمح لتحليل الجهاز كله مستقلة عن التأثيرات الجهازية، مع السماح التلاعب في مسار الإشارات معين أو التفاعلات الخلوية عن طريق إضافة الكواشف الدوائية أو الأجسام المضادة. تقليديا، ودراسة تطوير الجهاز الجنين قد اقتصر على التقنيات المعدلة وراثيا والماوس خروج المغلوب، بالإضافة إلى الكواشف الدوائية تسليمها للأمهات. ومع ذلك، هناك مسائل فنية تشمل هذه التقنيات والعلاجات في الجسم الحي. معظم المخاوف تدور حول آثار التأثير على مختلف الأجهزة في وقت واحد والذي غالبا ما يؤدي إلى الفتك الجنينية. مصدر قلق إضافي من الدراسات التلاعب نمو الجنين هو دواء تأثير الأمهات من المخدرات على التطور الجنيني داخل الرحم (على سبيل المثال، والتمثيل الغذائي الأمهات من الدواء قبل أن تصل إلى الجنين) وإذا كانت هذه الكواشف يمكن أن تمر من خلال حاجز المشيمة.
تقنية ثقافة الجهاز كلها وصفتهنا تم تكييفها من بروتوكول وصف لأول مرة من قبل معتوق وآخرون. 2، والتي يتم تحضين الغدد التناسلية الجنينية كلها في خارج الحي الثقافات قطرة تستقيم. واحدة ميزة كبيرة لزراعة الغدد التناسلية الجنينية هي أن مثبطات جزيء صغير يمكن الوصول بسهولة الجهاز كله عن طريق الانتشار البسيط. وقد أظهرت DeFalco آخرون أن استخدام هذا فيفو السابقين قطرة طريقة الثقافة بالتزامن مع مثبطات جزيء صغير يمكن أن تستخدم لدراسة العمليات والتفاعلات التي تحدث أثناء نمو الغدد التناسلية 3 إشارات؛ أن هذه العمليات سيكون من الصعب دراسة في الجسم الحي بسبب التحديات التقنية (على سبيل المثال، مرور المخدرات عبر المشيمة أو الفتك يصيب أعضاء متعددة باستخدام النهج وراثية أو الدوائية).
ثقافة الحبرية ليست فقط تحسنا في بعض الجوانب أكثر في الرحم التجريب، ولكن أيضا أن ذلك يعد تحسنا خلال في المختبر، وبحكم السادسنظم فو كذلك. استخدام خطوط الخلايا لدراسة التشكل من الصعب للغاية لأنها تفتقر إلى أنواع الخلايا المتنوعة، تفتقر إلى المصفوفة خارج الخلية (ECM) العناصر الأساسية التي تسمح تشكيل بنية الجهاز، ويمكن أن تظهر التحف في الإشارة شلالات. على الرغم من أن هندسة الأنسجة وإجراء تحسينات كبيرة في خلق السقالات محاكاة ECM، والافتقار إلى المعرفة فيما يتعلق وهي مطلوبة إشارات من قبل كل نوع من الخلايا خلال توالد يجعل صعوبة في بناء نظام جهاز في المختبر. وقد أنظمة أخرى خارج الحي أنشئت سابقا لدراسة توالد، أو بشكل أكثر تحديدا التشكل، وكانت ناجحة جدا للتصوير المباشر لأجهزة الجنين في أجار 4، transwells 5، 6 مرشحات، ومصفوفات سقالة أخرى 7،8. الاستفادة من نظام الثقافة الحبرية هو أنه يتيح دراسة التشكل من خلال توفير القدرة على الاستفادة من أقل الكواشف، والتي هي سften تكلفة، ولكن أيضا إعطاء التوتر السطحي الجهاز، وهو أمر مهم للنمو ويشير قدرات 9.
في الماوس، التشكل الخصية الأولي يحدث بين الجنينية (E) مراحل E11.5 وE13.5. وتشمل هذه المراحل نافذة الوقت الأمثل لدراسة العوامل التي تؤثر على التفرقة بين جنس معين. ومن بين العمليات الحيوية التي تحدث أثناء تشكيل الخصية هي الجيل العمارة الحبل الخصية وتشكيل شبكة الأوعية الدموية الخصية محددة. استخدام هذا الجهاز خارج الحي كله نظام الثقافة الحبرية، واحد قادر على تغيير الأوعية الدموية الخاص بالذكور وتمنع الخصية التشكل من خلال استخدام مثبط جزيء صغير الذي يمنع نشاط مستقبلات عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF)؛ بوساطة VEGF إعادة الأوعية الدموية هو أمر حاسم لتنمية الخصية 10-12. يمكن أن تطبق بنجاح هذه التقنية إلى الأجهزة الأخرى، ويمكن أن تستهدف وقت محددنوافذ التنمية. جبل لالجامع التصوير جهاز يسمح التصور من الهياكل الحيوية فضلا عن التغييرات الهيكلية والخلوية الناتجة عن إدارة مثبطات المختلفة. الأهم من ذلك، هذا النظام هو مفيد في هذا الباحث يمكن تجاوز آثار الخلط المحتملة من الدواء الأمهات أو التعطيل المنهجي في الجسم الحي خلال استراتيجيات الجينات المستهدفة. وهكذا، هذا الجهاز كله خارج الحي النظام الثقافة قطرات يمكن أن تحسن بشكل كبير من القدرة على فهم التفاعلات والإشارات التي تحدث بشكل خاص ضمن أجهزة خاصة أثناء التطور الجنيني.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه الدراسة المجراة سابقا كله الجهاز طريقة قطرة يحتوي على العديد من التطبيقات المحتملة لدراسة التطور الجنيني. هذه التقنية يمكن استخدامها لأجهزة متعددة، ويسمح الباحث لمعالجة المسائل الحيوية التي يصعب دراسة استخدام في الجسم الحي النهج بسبب عدم إم…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O’Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.
Materials
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | N/A | |
| 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II – CAS 269390-69-4 – Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
Referenzen
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
- DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
- Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
- Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
- Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
- Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
- Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
- Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
- Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
- Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
- Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
- Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
- Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
- Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
- Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).
