Isolatie van virale replicatie compartiment verrijkt Sub-nucleaire fracties uit adenovirus-geïnfecteerde normale menselijke cellen

Summary

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Abstract

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

Introduction

Adenovirussen een dubbelstrengs DNA-genoom, dat repliceert in de geïnfecteerde celkern. Als het virale DNA de kern binnengaat, is gelokaliseerd grenzend aan PML kernlichaampjes ^1. Naar aanleiding van de virale vroege genexpressie, wordt de nucleaire architectuur drastisch gereorganiseerd, het induceren van de vorming van virale micro-omgevingen, zogenaamde virale replicatie compartimenten (RC) ^2. Sinds adenovirus (Ad) RC zijn sites waar virale genoom replicatie en expressie van virale late genen plaatsvinden, ze bieden een omgeving voor de aanwerving van alle noodzakelijke virale en cellulaire factoren die deelnemen aan deze processen. Interessant is dat een verscheidenheid aan cellulaire eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de cellulaire antivirale respons, zoals de DNA-schade reactie de aangeboren immuunrespons en tumorsuppressie samen worden gekozen om deze virale plaatsen ^2. Daarom kan Ad RC worden beschouwd regelgeving hubs die een efficiënte virale replicatie te bevorderen, terwijl tegelijkertijd de regulering van decellulaire antivirale respons, wat aangeeft dat deze structuren zijn de sleutel tot het begrip van virus-gastheer cel interacties. Niettemin, de moleculaire mechanismen van RC vorming, de samenstelling en de bijbehorende activiteiten worden slecht begrepen.

Adenovirale RC, en RC uit andere DNA-virussen die repliceren in de kern wordt niet geassocieerd met membranen, in tegenstelling tot cytoplasmatische RC ^3. Bovendien zijn deze virus-geïnduceerde structuren waarschijnlijk geheel bestaande uit eiwitten en nucleïnezuren. RC gevormd in cellen geïnfecteerd met RNA-virussen (gewoonlijk aangeduid als virale fabrieken) zijn geïsoleerd, profiteren van hun cytoplasmatische lokalisatie en membraangebonden status waarin de gedetailleerde morfologische, functionele en biochemische karakterisatie ⁴ is vergemakkelijkt.

Voor zover wij weten, zijn virale kern RC niet geïsoleerd, misschien vanwege de complexiteit van de nucleaire architectuur en afwezigheid van intranucleaire membranes dat hun isolatie zou vergemakkelijken. Hun studie heeft vertrouwd in plaats daarvan op immunofluorescentiemicroscopie, vis en transmissie elektronen microscopie. Echter, ondanks de complicaties die inherent zijn aan het isoleren subnucleaire structuren, andere nucleaire domeinen zoals nucleoli en Cajal organen zijn geïsoleerd voordat ^5,6. Aangezien nucleoli en RC zijn beide samengesteld uit eiwitten en nucleïnezuren, en een diameter tussen 0,5 – 5 pm, veronderstelden we dat RC ook vatbaar afzonderlijk te beoordelen. Teneinde de moleculaire samenstelling en functies in verband met RC preciezer te karakteriseren hebben we een nieuwe werkwijze voor subnucleaire fracties verrijkt met RC isoleren. Daartoe hebben we bereid sub-nucleaire fracties behulp snelheidsgradiënten en sucrose kussens Soortgelijke procedures voor nucleoli ⁷ of andere nucleaire domeinen ⁶ isoleren en werd een celvrij systeem dat de studie van de moleculaire samenstelling en bijbehorende activiteiten mogelijk maaktRC. Deze techniek dient derhalve vooraf het begrip van virus-gastheer cel interacties en vormt een krachtig instrument dat ook een gedetailleerde analyse van RC dient te vergemakkelijken van andere virussen die repliceren in de kern en induceren de vorming van replicatie compartimenten van soortgelijke afmetingen aan die gevormd in adenovirus geïnfecteerde cellen, zoals herpesvirussen, papillomavirussen en polyomavirussen.

Protocol

1. HFF Cell Cultuur en Ad-infectie Propageren Ad5 WT virus in monolagen van HEK-293-cellen en titer als fluorescerende eenheden (FFU) op HFF cellen zoals eerder beschreven 8. Groei humane voorhuid fibroblasten (HFF) in 10 ml DMEM / 10% foetaal runderserum (FBS) in steriele kweek 100 mm schalen bij 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator. Bepaal het aantal cellen met een Neubauer kamer door het tellen van cellen in de vier 16-square sets. Het aantal cellen per ml wordt ve…

Representative Results

Aangezien virale replicatie compartimenten (RC) zijn subnucleaire viraal geïnduceerde structuren bestaande uit eiwitten en nucleïnezuren, vergelijkbaar met andere nucleaire domeinen, bleken zij vatbaar voor isolatie te worden door snelheidsgradiënten gebaseerd op biochemische kenmerken. Kritische stappen van de fractionering protocol worden geïllustreerd in figuur 1. Bij elke stap de monsters moeten worden gevolgd met helderveld microscopie om de integriteit van de verschillende subcellulaire fracti…

Discussion

In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th…

Materials

DMEM	Gibco	12100-046	Warm in 37 ºC water bath before use
Fetal Bovine Serum	Gibco	12484-028
Sucrose, Ultra Pure	Research Organics	0928S	Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC
Dounce homogenizer	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800 Ultrasonic Bath	Branson	Z769533 SIGMA	Turn on 15 min before use.
Peroxidase AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-036-003	Use at a 1:10,000 dilution in PBS/0.03% non-fat milk
Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21121	Use at a 1:2,000 dilution in PBS
Silane-Prep Slides	Sigma	S4651-72EA	Open in a laminar flow cabinet
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Pierce ThermoScientific	34080