Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki
Summary
Biz bir in vitro hazırlık kullanarak beyin çekirdekleri içine anterograd veya retrograd tracer enjeksiyonları yoluyla nöronlar ve süreçlerini etiketlemek için bir teknik açıklar. Biz i n markalama doğruluğunu artırmak amacıyla bir avantaj floresan işaretli fare mutantları ve temel optik donanım alarak izleyici elektroporasyon vitro varolan yöntemi değiştirilebilir.
Abstract
Biz işlem sırasında hedeflenen lazer aydınlatma ve uygun filtre gözlük ile beyin eksplantlarında elektroporasyon yoluyla boya alımını artırmak için elektrikli ve basınç darbeleri bir dizi kullanan bir in vitro izleyici enjeksiyon protokolü, birleştiren bir teknik sunuyoruz. Kendisi ile in vitro elektroporasyon tarif edilen teknik Beynin belirli bölgeleri, hedefleme için nispeten iyi bir görsel kontrol elde edilir. Lazer floresan genetik belirteçlerin uyarma ve onların okuma-out bant-geçen filtre gözlüğü aracılığıyla, genetik olarak etiketlenmiş hücre / çekirdekler ve floresan izleme boya emisyonlarını pick up hangi bir araştırmacı ölçüde enjeksiyon doğruluğunu artırabilir ile birleştirerek ilgi alanı bulma ve çok daha verimli enjeksiyon alanında boya yayılmış / alımı için kontrol ederek. Buna ek olarak, lazer aydınlatma tekniği ata, belirli bir neurocircuit işlevselliğini çalışma sağlarGFP tanımı, nöron bir alt tarafından ifade edilen verici tipine bağlı olduğu durumlarda, belirli bir alana uzanan nöronların türü hakkında bilgi iding.
Introduction
Belirli bir nöronal (mikro) devreyi tanımlamak için, dedi biri devre ve bunların bağlantı desen çeşitli katılımcıları bularak başlamalıdır. Hiç hasarının 1 ile nöroanatomik izleme tekniklerinin büyük bir çeşitlilik izleme neurofiber hakkında Waller'ın yayın kurulduktan bu yana. 1971 5-6 keşfedilen Bu tekniklerden bazıları, sabit bir doku otopsi 2-4 uygulanabilir, diğerleri, canlı nöronlar boyanın aktif taşıma dayanır. İkincisi daha (belirli bir projeksiyon kaynağına, yani enjekte alandan. Alan bahsedilen çıkıntılı olan nöronların somata) Aktif retrograd yararlanarak yöntemleri arasındaki ayrım iki gruba ayrılabilir ve aktif anterograde (enjekte itibaren Belirli bir projeksiyon hedefinin, yani. akson projeksiyonları ve etiketli nöronlar) ulaşım aksonal terminallerine alanı. Ayrıca, bazı durumlarda, tracer malzemesi daha sonra, diğer durumlarda eksplante beyinleri enjekte edilir ise, (in vivo tracer enjeksiyonları) birçok gün veya hafta enjeksiyon hayatta kalmak ve yapay serebrospinal akışkan içinde enjeksiyondan sonra birkaç saat süreyle inkübe canlı hayvan içine enjekte edilir (in vitro iz enjeksiyonları) .
Bu protokolde vitro elektroporasyon tekniği 7-8 mevcut bir izleme maddeler olarak choleratoxin alt birimi-b ve tetrametilrodamin dekstran kullanarak anterograd ve retrograd izleme deneylerinde nöronal somata ve süreçleri etiketlemek için güncellenmiştir. Bu protokolün genel amacı izli enjeksiyonlar sırasında hedefleme hassasiyetini artırmak amacıyla mevcut transgenik fare hatları ve temel optik cihazlar yararlanarak, farklı beyin çekirdekleri arasındaki nöronal bağlantı desenleri iz etkin bir araç ile sinirbilimcileri sağlamaktır. Anterograd ve retrograd izleme yöntemi kullanılarak rağmencholeratoxin dekstran amin ve ilgili floresan etiketli eşlenikler 9-13 yeni değildir (örneğin. Haas ve arkadaşları elektroporasyon gibi bir yöntem olduğu için. 14), beyin dokusu bloklarını ihtiva eden bir in vitro hazırlama elektroporasyon tracer enjeksiyonu kombinasyonunun Daha yeni bir gelişme 7'dir. Canlı hayvanların tracer boyalar aynı tip kullanılarak nöronal izleme teknikleri esas avantajı, çünkü elektropore boya nöronlar tarafından alınır olarak hangi daha yüksek verimlilik, artmış etiketleme yoğunluğudur. Deneyci enjeksiyon ilgili hedef alanı üzerinde bir görsel kontrol, çünkü ek bir avantajı, izleyici enjeksiyon sırasında (boya nakil için gerekli) kısaltılmış inkübasyon süresi ve artan hedef doğruluğudur. İkincisi de pahalı stereotaktik ekipman ilgi çekirdeği veya beyin alanı bulmak için gerekli olduğu anlamına gelir.
Addin içinduğunda biz 405 nm dalga boyu ve eşleştirme band geçiren filtre gözlük bir el lazer pointer (450 oluşan nöronlar 15 ve temel optik donanımın glycinergic alt popülasyonunda GFP ifade transgenik fare hattı, yararlandı, doğruluk hedefleme artış – 700 nm). Böylece, onun floresan sinyali ile enjeksiyon alanını belirleyerek doğruluğu hedef ve yerli GFP sinyal ve izleyici arasındaki etkileşimin gözlem yoluyla enjeksiyon alanı içinde boya yayılması kontrol etmek için daha ince bir yol sağlayarak önemli bir başka artış elde ışık vermiştir. Bizim teknik aynı zamanda izleyici ile doldurulmuştur (diğer fare hatları ya da eksitatör) onun GFP pozitif inhibitör nöronları belirleyerek bağlantısı ile birlikte devrenin işlevselliğini ortaya çıkarmak için izin verir.
Özetle, biz daha omurgalı beynin connectome incelemek ve değerlendirmek için t güçlü nörobilimsel araç gelişmişO belirli bir neurocircuit farklı nöroanatomik özellikleri. Ucuz ve yaygın olarak kullanılan optik cihazlar ile birlikte transgenik fareler kullanarak önemli ölçüde bizim enjeksiyonları hedef doğruluğunu artırmak için başardık. Ayrıca, transgenik fareler işitsel beyinsapı bir inhibitör mikrodevre işlevselliğini ortaya çıkarılması yardımcı takip bağlantıları, tipini belirlemek için bize izin verdi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo izleme çalışmaları aksine in vitro izleyici elektroporasyon genel gücü, pahalı stereotaktik (ve genellikle elektrofizyolojik) ekipmanı içermeyen, bu araştırmacılara dolayısıyla faiz ve beyin alanına daha iyi erişim sağlamasıdır. Dekstran aminler ve diğer izleyiciler kullanımı ile ilgili ayrıntılı bir inceleme (bkz in vivo izleyici enjeksiyonları halinde yerine günler veya haftalar – Buna ek olarak, beyin eksplant için gerekli yaşam süresi sadece birkaç sa…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH tarafından desteklenen / NIDCD R01 DC 011582. Görüntüleme deneyleri Colorado Anschutz Tıp Kampüsü Gelişmiş Işık Mikroskopi Çekirdek Üniversitesi yapılmıştır NIH / NCRR Colorado CTSI Hibe Numarası UL1 RR025780 ve Rocky Mountain Neurlogical Bozuklukları Çekirdek Merkezi Grant NIH P30NS048154 kısmen desteklenmiştir. Salk Enstitüsü'nden Dr. Sascha du Lac GlyT2-GFP farelerde ile sağladı.
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
Referenzen
- Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
- Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
- Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
- Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l’Homme et des vertébrés. , (1911).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
- Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
- Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
- Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).
- Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
- Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
- Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Zwicker, E., Fastl, H. . Psychoacoustics Facts and Models. , (1990).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
- Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
