Einfache und genaue Mechanotherapie Profilierung Micropost Arrays

Summary

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Abstract

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.

The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.

A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Introduction

Mechano empfindlichen zellbasierte Assays ermöglichen die Untersuchung von adhärenten Zellen, mit einer breiten Palette von Anwendungen, die die zentrale Rolle, die Mechanik in der Zellbiologie spielen reflektieren. Diese Anwendungen konzentrieren sich oft auf die zugrunde liegenden Mechanismen, die subzelluläre Prozesse oder Ganzzellverhalten zu fahren. Einerseits können externe Umweltfaktoren, wie die extrazelluläre Matrixzusammensetzung oder Matrixsteifigkeit dramatischen Einfluss auf die mechanischen und biologischen Antwort der Zelle. ^{1 Das gleiche} kann nach der Verwendung von vielen Klassen von pharmazeutisch wirksamen Verbindungen beobachtet werden, deren Wirkungen sind häufig unter Verwendung von Zellkulturmodellen charakterisiert. ^{2 auf der} anderen Seite genotypischen Eigenschaften, wie sie durch spontane oder experimentell induzierter Genmutationen verursacht werden, können starke Änderungen Zellphänotypen, die mit Veränderungen im Zytoskelett Struktur und Funktion zugeordnet sind induzieren. ³ Diese Beispiele sind nur ein paar der vielen möglichenThemen, für die mechanische Phänotypisierung der Zellen von Bedeutung ist, und alle diese sind zweckmäßigerweise mit micropost Arrays untersucht.

Zum Zeitpunkt des Schreibens dieses Artikels, haben rund 200 Artikeln veröffentlicht worden beschreiben zell micropost Interaktion. Diese Arbeiten diskutieren theoretische Aspekte der micropost Ablenkung Grundlagen sowie praktische Hinweise zu deren Herstellung. Der erste Artikel der Wechselwirkung von Zellen und flexible micropost Arrays beschreibt, wurde von Tan und Kollegen im Jahr 2003 ⁴ veröffentlicht Im Gegensatz zu klassischen Traktionskraft-Mikroskopie (TFM), wo kontinuierliche weichen Substraten verwendet werden, um Nanonewton-Wägezelle Kontraktilität, Tan et al schätzen. ein Verfahren beschrieben, unter Verwendung von mehreren eng beabstandeten vertikalen Balken aus Silikonelastomer hergestellt. Die Hauptvorteile dieser Technik ergeben sich aus zwei Hauptfunktionen. Erstens, um die Zell-Substrat scheinbare Steifigkeit zu ändern braucht man nur die micropost Abmessungen verändern, währendDie Substratzusammensetzung ansonsten konstanten und wodurch Unterschiede in der Oberflächentopologie und Chemie. Zweite microposts handeln wie einzelne Federn, die diskret mit Kraft und räumlichen Auflösungen in der Größenordnung von einzelnen fokalen Adhäsionen untersucht werden kann und die analytischen Herausforderungen, die inhärent analoge Analyse durch Standard-TFM sind zu reduzieren.

Heute ist die Palette von Anwendungen für micropost Arrays stark gerade die Abbildung der Kräfte für ein paar Einzelzellen überschreitet. So berichtet Akiyama die Verwendung eines isolierten Rückengefäß Gewebe von einem Falter Raupe als Aktuator für eine micropost Array, um ein Insekt mit Muskelkraft betriebene autonome Mikroroboter zu entwickeln. ⁵

Allerdings haben die meisten Veröffentlichungen zur microposts auf Studien von Erkrankungen wie Infektionen oder Krebs. Zum Beispiel haben micropost Arrays verwendet, um die Krafterzeugung von gebündelten Typ IV-Pili von Neisseria gonorrh studierenOEA Kolonien, die mit Signalkaskaden Verbesserung Infektion assoziiert ist. ⁶ Andere haben microposts verwendet, um Brustkrebszellen mit pharmazeutischen Verbindungen zur Förderung der Zytoskelett behandelt zu studieren. ⁷

Ablenkung eines micropost wird oft mit klassischen Balkentheorie beschrieben, für einen Freischwinger mit einem Ausgabeaufschlag unter der Annahme der Zelle misst nur auf die Spitze der micropost. Hier wird die aufgebrachte Kraft F, die eine Durchbiegung δ verursacht, hängt von der micropost des "Biegesteifigkeit" k und wird berechnet durch:

(1)

mit E, I, und L der Elastizitätsmodul, Flächenträgheitsmoment und Strahllänge auf. Allerdings ergibt sich aus dieser Gleichung geben nur einen allgemeinen Angleichung der Kräfte am Werk, da Strahl Scher- und Biege sowie Substrat Verziehen nicht in ac getroffenGraf. In Anbetracht, dass microposts werden typischerweise aus weichen Materialien wie Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt -basierte Silikonkautschuk müssen diese Faktoren einbezogen werden. . Schoen et al gezeigt, daß es eine solche Korrekturfaktor auf der Basis des Seitenverhältnisses des micropost (L / D) und der entsprechenden Polymer Poissonzahl v ⁸ Es wird durch gegeben.:

(2)

Mit _T-Neigung (v) ein Neigungskoeffizienten, die Anpassungsparameter a = 1,3, wie in dem gleichen Artikel gefunden werden enthält:

(3)

Das bedeutet, dass ein micropost korrigiert Steifigkeit k _corr ist das Produkt aus dem reinen Biegesteifigkeit k = k _{Kurve und} der Korrekturfaktor Korrgegeben durch:

(4)

Daher sollten Zellkraftberechnungen unter Verwendung des verfeinerten Variante der Gleichung (1) gerade lesen werden:

(5)

Die Auswirkungen der Korrektur offensichtlicher, sobald typische Werte für micropost Abmessungen eingesetzt werden. Zum Beispiel ein 15-Mikron lang micropost mit einem kreisförmigen Querschnitt und einem Durchmesser von 5 um aus PDMS-basierten Silikonkautschuk führt zu einem Korrekturfaktor von 0,77 und somit eine korrigierte Berechnung würde der ausgeübten Kräfte Zelle um 23% zu überschätzen. Dies wird umso schwerer für microposts mit kleineren Seitenverhältnisse.

Traditionell wurde micropost Bildanalyse auch auf idealisierten Strahlbiegetheorie basiert. Im Jahr 2005 die Gruppe, die die Verwendung von MICR-Pionieropost Arrays veröffentlichte eine Bildanalyse-Software für micropost Analyse geeignet ⁹ Die Software benötigt eine Software-Lizenz und der Benutzer muss drei Bilder für jede Position zu nehmen. jeweils einer aus oberen und unteren Ebenen der micropost im Sendemodus und ein anderer in der Fluoreszenzmodus mit dem gefärbten Zelle. Nach einem Vergleich der oberen und unteren Positionen für jede micropost die Software bestimmt einen Kraftvektor Feld und berechnet damit verbundenen Parameter wie Kraft pro Beitrag. Andere Softwarepakete bestehen und deren Analyse Prinzipien werden kurz in die entsprechenden Artikel, die sie beschreiben, erwähnt, aber diese Analysesoftwarepakete sind in der Regel nicht öffentlich verfügbar. ^10,11

Die micropost Anordnungen zum Abbilden von Zellkräften konstruiert werden kann als welche entweder in einer orthogonalen micropost Layout oder einem hexagonalen ein, von denen die letztere den Vorteil haben äquidistanten Abstände zwischen allen benachbarten microposts klassifiziert werden. Typische microposts have einen runden Querschnitt und ihre Abmessungen im Bereich von 1,0 um bis 10 um im Durchmesser und 2 bis 50 um in der Länge. ⁴ jedoch microposts mit elliptischen oder quadratischen Querschnitt haben ebenfalls berichtet. ^12,13

Die Verwendung von PDMS-basierten Silikon-Mischungen als micropost Material ermöglicht zum Addieren Nanopartikel in der Mischung. Zum Beispiel das Hinzufügen Cobaltnanostäbe ermöglicht eine magnetische Aktivierung des micropost und somit gibt einen weiteren Freiheitsgrad, um mögliche experimentelle Designs. ¹⁴ Die meisten Gruppen auf flachen starren Substraten wie Deckglas oder in einer Petri-Schale produzieren ihre micropost Arrays. Allerdings Mann und Mitarbeiter berichteten kürzlich über eine micropost Array auf einem dehnbaren Membran gebildet. ^15. Dies ermöglicht die Anwendung von Zelldehnungskräfte an anhaftenden Zellen während des Studiums lebenden Zellen subzellulären dynamischen Reaktionen in Bezug auf Zellkontraktilität.

Die breite Anwendung und die meisten Established Verfahren zur Herstellung micropost Arrays auf Weich-Lithographie, wie in den Protokollen der aufschluss Sniadecki und Kollegen. ^16-18 Kurz Standardreinraumprozesse beschrieben werden, verwendet werden, um die Mikrostrukturen auf einem Siliziumwafer unter Verwendung von Fotolack SU8 Ganzes erzielt. Dies wird durch ein Kopierverfahren, bei dem der Silikonkautschuk über die Strukturen ihre Übertragung in Formen gegossen, gefolgt. In einem zweiten Schritt diese Formen werden verwendet, um die anfängliche Mikrostruktur unter Verwendung von Silikonkautschuk auf einem gewählten Substrat replizieren. Doch trotz der großen und wachsenden Zahl von Publikationen, um ihre Anwendung beziehen, zur Schaffung einer Herstellungsprozess für microposts nimmt sehr viel Zeit sogar für Mikrotechnik-Experten; es gibt viele Prozessschritte, die Optimierung und Anpassung an die spezifischen Testumgebung und micropost Layout benötigen, um ein akzeptables Qualitätsniveau zu liefern.

Kommerzielle micropost Arrays sind jetzt in einer ready-t verfügbaro-Nutzung ("off-the-shelf") Format mit einer gleichbleibend hohe Qualität. Als solche sind sie eine Alternative zu dem Vor-Ort-Erzeugung erforderlichen komplizierten und langwierigen Herstellungsprozess. In dieser Arbeit wurde ein im Handel erhältlicher micropost Array zur Abbildung zellulärer Kräfte mit einem einzigen Bild Hellfeldmikroskopie verwendet. Noch wichtiger ist in diesem Artikel beschrieben und dokumentiert eine voll funktionsfähige Open Source-Software mit dem Namen MechProfiler, die zum Download als Begleitmaterial zu diesem Manuskript zur Verfügung steht. Eine aktiv gepflegte Version der Software finden Sie auch bei http://www.orthobiomech.ethz.ch gefunden werden.

Die Kombination aus einem "off-the-shelf" Assay und einem kompatiblen Open-Source-Analyse-Software deutlich senkt die Eintrittshürde, um genaue TFM Experimenten zu erreichen. Forscher ohne Zugang zu entweder Reinraumanlagen oder Software-Entwicklungskompetenz können zelluläre Kräfte erfolgreich zu analysieren. Es einem Benutzer ermöglicht, auf den mechanos konzentrierenensitivity Assay Ausgangs anstatt die Technologie selbst, und macht Zugkraftmessungen zur Verfügung, um eine breitere Gemeinschaft. Darüber hinaus ist dies ein wichtiger Schritt, um den Weg zur vollautomatischen Überprüfungen micropost Arrays zu ebnen.

Die MechProfiler Analyse-Software verarbeitet Bilder in Dateiformat TIFF, PNG, BMP und JPG. Bilder können unter Verwendung von Fluoreszenz, Phasenkontrast und Hellfeld-Lichtmikroskopie genommen werden. Die Standalone-Programm läuft zusammen mit dem freien Matlab Compiler Runtime (verfügbar unter: Abbildung 12) und die zugrunde liegenden Algorithmen erlauben schlanke Bildverarbeitung, die dem Benutzer ermöglicht, Bilder mit einzelnen oder mehreren Zellen in etwa 1 min zu verarbeiten. Ferner können diese Zellen entweder lebenden oder "fixiert".

Die MechProfiler Software kann die Datenanalyse Durchsatz stark zu erhöhen, indem sie sich auf die Reproduzierbarkeit der Qualität kommerzieller micropost Anordnungen, genauer gesagt, die Standard & #8220; nicht abgelenkten "Position jeder Eintrag in der Anordnung gegen ein ideales Raster ausgegangen werden (für das Gitter in der für diese Studie verwendeten Arrays Fertigungsabweichungen betrugen weniger als 100 nm).

Kurz öffnet man eine Auswahl von Bilddateien für die Analyse, schneidet sie in den Bereich von Interesse definiert, die Beiträge von Zellen bedeckt oder die verworfen werden müssen, bestimmt die Postpositionen, berechnet die Durchbiegungen / Kräfte gegen idealen Rasters und schließlich speichert alle zellspezifischen Daten mit der Möglichkeit für den Export, darunter zu einem Standard-Office-Tabellenkalkulation.

Protocol

1. Kultivieren von Zellen auf Micropost Arrays Hinweis: Alle Schritte müssen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt, um die Sterilität zu gewährleisten. Die hier angegebenen Volumina sind für T25 Zellkulturflaschen. Das Zellkulturmedium Rezept und Zellaussaatdichte für Knochenkrebszelllinien HuO9 und M132 optimiert. Bereiten Sie eine Zellkultur für die Aussaat auf eine micropost Array. Untersuchen Sie den Zellkulturqualität, indem die Kulturflasche auf einem…

Representative Results

Der Hauptvorteil der beschriebenen Technik liegt in seiner Einfachheit und das Potenzial für eine schnelle und effektive Integration in die Routinelaborarbeiten. Die Kombination von hochwertigen kommerziellen Sensoranordnungen gepaart mit Open-Source-Software bietet Informationen über mechanisch-Empfindlichkeit, die sonst benötigt würde den Zugang zu Reinraumausstattung und vertiefte Kenntnisse der Bildanalyse und Softwareentwicklung. 1 veranschaulicht den Workflow des vorgestellten Verfahrens. Es b…

Discussion

Diese Arbeit zielt darauf ab, den Bereich der Traktionskraftmikroskopie durch im wesentlichen Senkung technischen und praktischen Markteintrittsschranken voraus. Diese Barrieren kommen von zwei Seiten. In erster Linie sind die zahlreichen nicht-triviale technische Herausforderungen, die überwunden werden müssen reproduzierbar herzustellen und experimentell zu beauftragen eine micropost Array werden. Zweitens ist die in ähnlicher Weise nicht-triviale Bedarf an einer zuverlässigen halbautomatische Analyse von Einzelze…

Materials

T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions:
pre-coated with Collagen I/Fibronectin			Ø= 6.4 µm, l=18.2 µm; grid= 13 µm, kcorr= 2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera