İzolasyon, Karakterizasyonu ve Dişeti Bağışıklık Hücre Ağı Fonksiyonel Sınav
Summary
Biz izolasyon, fenotipik karakterizasyonu ve kemirgen dişetinin gelen bağışıklık hücrelerinin fonksiyonel analiz için bir teknik kurduk.
Abstract
Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.
Introduction
Gingival dokusu, insan ve murin diş yapısına çevreleyen sürekli diş 1 kompleks biyofilm maruz kalmaktadır. Dişeti bariyeri polislik bağışıklık hücre ağı patojenik meydan 2 karşı etkili bağışıklık sağlayan, aynı zamanda, doku bütünlüğünü korumak, yerel ortakçı mikroplarla homeostazisini sağlanması ve hayati önem taşımaktadır. Homeostazı elde etmek için, bağışıklık sistemi dikkatlice henüz küçük ayrıntı dişeti bağışıklık hücre popülasyonlarının ve doku bağışıklığı 2 korunmasında rolleri bilinen bir yüksek ihtisas bağışıklık hücre ağı oluşturma dişeti çevre için hazırlanmıştır.
Immün homeostasisin gingiva de bozulduğu zaman, ya da daha büyük bir konakçı karşı duyarlılık ve / veya disbiyotik mikrobiyal topluluklar, enflamatuar bir durumun varlığı sayesinde, periodontit 3 4 ortaya çıkar. Periodontitis diş s kaybına yol açan yaygın bir inflamatuar bir hastalıktıraltlık yapılar. Onun ağır formlarında genel nüfusun 5 yaklaşık% 10'unda görülür. Periodontitis duyarlılık ve ilerlemesinde rol önemli faktörler Kesme 6 zor olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, hayvan modelleri periodontitis başlangıcında ve ilerlemesinde 7 mekanizmalarını anlamak son derece yararlı olmuştur. Modeller bağışıklık homeostazı ve periodontitis sürücü gelişimini sürdürmek için hayati önem taşımaktadır anahtar hücre popülasyonlarının ve moleküler mediatörler tanımlamak için kullanılabilir. Böyle bir anlayış bağışıklık homeostazı dişeti özgü kontrol anlayışımızı dönüşümü ve hastalık patogenezinde güncel anlamanız açısından çok önemlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut teknik, başarılı bir şekilde uygun bir (tek bir fare), bağışıklık hücrelerinin büyük sayısını verir, sadece fenotipik karakterizasyon için değil, aynı zamanda fonksiyonel çalışmalar için ex vivo. Başka bir grup daha önce izole ve fare dişeti bağışıklık hücreleri karakterize bir protokol yayınlamıştır ve hayvan modellerinde 9 periodontitis çalışmada flow sitometri çok renkli kullanarak değerini tanıştırmıştı. Önemli sorun giderme Bu protokolde anah…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors were funded in part by the intramural program of NIDCR (N.M.M) and supported by a Wellcome Trust Stepping Stones Fellowship (097820/Z/11/B to J.E.K) and by a Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research grant (to J.E.K). The authors thank Teresa Wild for critically reviewing the manuscript.
Materials
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3mL |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 mL tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 mL FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
Referenzen
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., & Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Belkaid, Y., & Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
- Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
- Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
- Eke, P. I. Et Al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
- Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., & Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. (2015).
- Hajishengallis, G., Lamont, R. J., & Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
- Sharrow, S. O. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology / Edited By John E. Coligan … [Et Al.]. Chapter 5, Unit 5 2 (2001).
- Arizon, M. Et Al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
- Moutsopoulos, N. M. Et Al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229ra240 (2014).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., & Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).
