Visualisation des Twitching motilité et caractérisation du rôle de la<em> Pilg</em> in<em> Xylella fastidiosa</em
Summary
Dans cette étude, une chambre d'écoulement nano-microfluidique a été utilisé pour visualiser et caractériser fonctionnellement la motilité des secousses de Xylella fastidiosa, une bactérie qui cause la maladie de Pierce de la vigne.
Abstract
Xylella fastidiosa est une bactérie non flagellée Gram négatif qui provoque un certain nombre de maladies économiquement importantes de plantes. La motilité des secousses fournit X. fastidiosa un moyen de déplacement à longue distance intra-plante et de la colonisation, contribuant à la pathogénicité dans X. fastidiosa. La motilité tics de X. fastidiosa est exploité par pili de type IV. Pili de type IV de Xylella fastidiosa sont réglementés par Pilg, un régulateur de chimiotactisme dans Pil-Chp codant pour des protéines de l' opéron qui sont impliqués avec des voies de transduction du signal. Pour élucider le rôle des Pilg dans la motilité des secousses de X. fastidiosa, un Pilg mutant déficient Xf ΔpilG et sa souche complémentaire XfΔpilG- C contenant native Pilg ont été développés. A chambres microfluidiques intégrés avec un système d'enregistrement d'image time-lapse a été utilisé pour observer la motilité des contractions dans XfΔpIlg, XfΔpilG- C et sa souche de type sauvage. Grâce à ce système d'enregistrement, il permet des observations spatiales et temporelles à long terme de l' agrégation, la migration des cellules et des populations de bactéries via des tics motilité individuels. X. fastidiosa type sauvage et complémentaire souche XfΔpilG- C ont montré des caractéristiques typiques des secousses de la motilité directement observées dans les chambres d'écoulement microfluidiques, alors que le mutant XfΔpliG présentait le phénotype déficient secousses. Cette étude démontre que Pilg contribue à la motilité des secousses de X. fastidiosa. La chambre d'écoulement microfluidique est utilisé comme un moyen pour l' observation des tics motilité.
Introduction
Xylella fastidiosa est une bactérie pathogène Gram-négatif non flagellé, qui provoque un certain nombre de maladies des cultures économiquement importantes, y compris la maladie de Pierce de la vigne (Vitis vinifera) 1,2, 3. Cette bactérie est limitée à la xylème conduite d'eau navires. Infection de la vigne provoque le blocage des vaisseaux du xylème et des résultats dans le stress hydrique et les carences nutritionnelles 3. Colonisation réussie dépend de l'aptitude de la bactérie à se déplacer à partir du site initial d'infection pour le reste de la plante 3. Secousses motilité est un moyen de mouvement bactérienne flagellaire indépendante à travers l'extension, l' attachement et la rétraction de type polaire IV pili 4 qui a été caractérisé en X. fastidiosa 5,6,7.
La motilité des secousses a été observé par des pinces laser et microscopie à force atomique (AFM) 8,9,10. En utilisant ces techniques, tmotilités witching générés par type IV pili de N. gonorrhoeae et P. aeruginosa ont été caractérisées par fl pili d'étiquetage uorescently et capturer leurs mouvements microscopiques. Bien que les deux méthodes ont détaillé la force adhésive de bactéries individuelles, les procédures sont compliquées et prennent du temps 9,10. Les micro fl uidique chambres ont été utilisés pour observer la migration à longue distance des cellules individuelles, ainsi que de petits agrégats de cellules bactériennes 5,6. Ces chambres ont été conçues comme un nano-canal microfabriqué dans une plaque intégrée avec un time-lapse système d'enregistrement d'image 11,12,13,14. Micro fl dispositifs de chambre uidique offrent plusieurs avantages pour étudier le comportement de mouvement et cellule-cellule interactions de bactéries: (i) il fournit une plate-forme intégrée avec de multiples capacités de canal; (Ii) il peut examiner les motions et agrégations de cellules individuelles dans les caractéristiques à l'échelle nanométrique de bactéries; (Iii) elle permet m directeicroscopic enregistrement d'images de cellules bactériennes et l'analyse time-lapse, (iv) il fournit des observations spatiales et temporelles à long terme des populations individuelles et / ou de bactéries dans un micro-environnement; (V) le débit du milieu de culture dans un canal peut être contrôlée avec précision et (vi) seulement un très petit volume (1 ml) de milieu de culture est nécessaire pour chaque expérience.
Récemment, le fl uidique fl ow système micro a été utilisé pour étudier les comportements des cellules bactériennes dans diverses microenvironnements 14,15,16. L'adhérence et la fixation de surface de E. coli 15 X. fastidiosa 16 et Acidovorax citrulli 14 aux surfaces de verre ont été évaluées à l' aide de micro fl uidique chambres. La formation et l' agrégation bio fi lm médiée par pili de type IV de Acidovorax citrulli ont été analysées 14. En outre, le mouvement de A. citrulli observée sous fl ux conditions ont démontré que le pili de type IV peut jouer un rôle important dans la colonisation et la propagation de A. citrulli dans les vaisseaux du xylème sous aubier fl ow conditions. Les motilités de secousses de Pseudomonas aeruginosa et X. fastidiosa cellules ont été observées avec succès contre un courant de fluide dans une chambre d'écoulement microfabriqué 5,6,17. Pili de type IV deficient mutants et PilB pilQ de X. fastidiosa ont été trouvés pour modifier profondément la vitesse de secousses motilité dans les conditions de fl ux dans les micro – dispositifs fl uidique 5,6,18. Les études menées sur l' adhésion des bactéries et de la mobilité dans des dispositifs micro fl uidique indiquent que les micro fl uidique chambres sont particulièrement appropriés pour l' analyse de la motilité des tics et de la migration des bactéries médiée par pili in vitro. Ces résultats expliquent le mécanisme de migration des contractions médiée qui facilite la fixation cellule-cellule, l'agrégation et de la colonisation dans lesl'hôte, éventuellement conduire à une infection systémique.
Pil-Chp opéron de X. fastidiosa contient Pilg, Pili, pilJ, Pill, CHPB et epa signal qui encode la transduction pathways 20. Les chémorécepteurs transmembranaires lient des stimuli chimiques dans le domaine périplasmique et activent une cascade de signalisation dans leur partie cytoplasmique de contrôler finalement bactérienne tics motilité. Dans l'opéron Pil-Chp de X. fastidiosa, une protéine phospho-Pilg de navette est un homologue de CheY. Dans E. coli et P. aeruginosa, CheY est le régulateur de réponse dans les systèmes de chimiotaxie qui interagissent avec les protéines motrices de flagelles 19, 21. Bien que les contributions de l'opéron Pil-Chp vers la virulence dans X. fastidiosa a été examinée récemment 20, le rôle de la chimiotaxie Pilg dans opéron en réponse aux signaux de l' environnement régulé et / moteur pili de type IV de X. fastidiosa est unclear. Pour élucider la compréhension du régulateur de chimiotaxie Pilg dans l'activité de motilité des tics X. fastidiosa, une chambre fl uidique micro est utilisé pour évaluer la motilité des secousses de X. fastidiosa. Le Pilg de X. fastidiosa se caractérise en comparant les phénotypes d'un mutant de délétion Xf ΔpliG, souche complémentaire XfΔpliG C et son type sauvage in vitro. Les résultats mettent en évidence le rôle de Pilg dans la motilité des secousses de X. fastidiosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons caractérisé le comportement de mouvement de X. fastidiosa Pilg mutant Xf ΔpilG et ses souches complémentaires XfΔpilG- C dans nouvellement conçu-nano-canaux parallèles micro multiples chambres fl uidique. Les nouvellement conçu micro fl uidique chambres peuvent avoir jusqu'à quatre chambres parallèles avec 100 um nano-canal dans la largeur par rapport aux modèles antérieurs avec un seul 50 m de large canal 18. Le canal …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service. Les noms commerciaux ou de produits commerciaux dans cette publication sont mentionnés uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et ne signifie pas qu'ils sont approuvés par le ministère de l'Agriculture des États-Unis. L'USDA est un fournisseur d'égalité des chances et de l'employeur.
Materials
| Biology materials | |||
| X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type | Costa, H. S., et al., 2004 22 | ||
| pilG deletion mutant XfΔpliG | Shi, X. Y., et al., 2007 26 | ||
| pilG complementary strain XfΔpliG-C | Davis, M. J., wt al. 1998 23 | ||
| Physical materials and equipment | |||
| Disposable inoculating loops | VWR international, Radnor, PA | #22-363-607 | quantitative procedures such as bacterial collection |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | #0002709226 | Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits |
| AmScope MD2000 digital camera | AmScope, Irvine, CA | SE305R-AZ-E | Image, video recording and measurement |
| Tubes line | Edgewood, NY | #T4300 | Connected to the syringe and microfluidic chamber |
| Plastic luer connectors | Edgewood, NY | Connected to the syringe and microfluidic chamber | |
| Syringe pumps | Pico Plus, Harvard Apparatus, MA | #702209 | The flow rate can be adjusted while the pump is running. |
| Syringes | Gastight, Hemilton Company, Reno, NV | #1005 | Provide the flowing broth |
| Inverted Olympus IMT-2 microscope | Olympus | IMT-2 FLuoro PHase | Image observation and recording |
| SPOT-RT digital camera | Diagnostic Instruments, Inc., MI | RT230 | Image, video recording and measurement |
| Microscope Shutter | The UNIBLITZ, US | #LS2T2 | Control camera’s exposure time |
| Microscope Shutter Control system | The UNIBLITZ, US | VCM-D1 | VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver |
| MetaMorph Image software | Universal Imaging Corp., PA | Real-time super-resolution image processing |
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