誘導気道のパターニング時にWntシグナル伝達を学びます
Summary
全体のマウントと切片染色に連結されたレポーターマウスの使用、顕微鏡およびin vivoアッセイは、気道の正常なパターニングのメカニズムの解析を容易にします。ここでは、これらの技術は気管開発中のWntシグナル伝達の解析にどのように貢献したかを説明します。
Abstract
Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.
Introduction
気道の開発は腹側内胚葉の前腸1,2におけるNkx2.1陽性細胞の出現と日胚9（E9）により開始されます。管は別個のエンティティとして区別することができるときに食道・気管チューブ分離は、E11.5によって間葉組織3で囲まれたを解決します。 Wntシグナル伝達は、肺の発育不全4,5になります内胚葉気道上皮からの内臓間葉とβカテニンの欠失によって表現さWNT2とWnt2bの削除など気道の仕様に重要な役割を果たしています。我々の以前の研究では、肺の発育不全における内胚葉気道結果から、肺血管の開発および気管間葉6,7の誤パターニングの欠陥をWLSの削除、すべてのWntリガンドの分泌を媒介する貨物の受容体を決定しました。これらのデータは、上皮間葉CROの重要性をサポートそれはまた、他の研究8,9に示されているように、SSは、細胞分化および仕様で話します。
肺の開発の初期段階の研究では、私たちはより良い呼吸アイデンティティ10-16を駆動する機構を理解することができましたvitroおよびex vivoの技術では、遺伝的に依存しています。空気液体間期における全肺外植片培養物を広く形態形成10,17,18に分岐肺の初期段階での成長因子の効果を研究するために利用されています。この方法は、形態素など分枝形態形成などの変更、および遺伝子発現調節の読み出しとして使用されているが、それは文化そのものが血管系17の開発をサポートしていないとして、発達過程の初期段階の研究に限定されています。気管軟骨の発達は、この培養技術と互換性がないとすることができる、より長いインキュベーション時間を必要とします。
アナライザーへ電子気道形成中のWntシグナル伝達の役割は、私たちは、胚の研究のニーズを満たすために、標準的な技術を適応しています。我々は、気管・肺組織の清算のためのパラフィン包埋し、タイミングのためにボリューム、染色倍、処理サイクルを変更しました。本研究に記載された技術の最適化の主な目的は、E14.5までE11から行わマウスにおける気管開発の初期段階を分析することでした。レポーターマウスラインAxin2LacZ開発気管間充織におけるWnt /βカテニン活性を、我々正確に決定部位を使用して。また、全体のマウント気管組織のためのレクチン染色法を適応しています。したがって、我々は、間葉系縮合を視覚化し、軟骨形成が行われる部位を予測することができました。高度な顕微鏡技術と相まって、全体のマウントとWlsShhCreのマウスから得られた胚組織の切片の染色は、私たちはTRAによって生成されたWntリガンドの役割を明らかにするために許可されました気管パターニングでCHEAL上皮。
Protocol
Representative Results
Discussion
気道の形態形成の基礎となるイベントは、完全に、誘導気道のパターニングのために必要な、特にプロセスを理解されていません。以前の研究では、現像外植片が気液相間での培養またはマトリゲル21,22内に埋め込まれている、請求エキソビボ技術を利用しています。これらの研究は、成長因子は現像気管のパターニングおよび気管軟骨の形成にどのように影響するかを示して…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、組織学的手順で共焦点イメージングとゲイルマッケとマイクMuntiferingとマットKofronの支援を認めます。この作品は、部分的に健康NHLBI（DSへK01HL115447）の国立研究所によってサポートされていました。
Materials
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10x. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
Referenzen
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