Ganzkörper-Massenspektrometrie Imaging durch Infrarot-Matrix-assistierte Laser-Desorptions-Elektrospray-Ionisations (IR-MALDESI)
Summary
A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.
Abstract
Ambient Ionisierungsquellen für die Massenspektrometrie (MS) sind das Thema von großem Interesse in den letzten zehn Jahren. Matrix-unterstützte Laser – Desorption Elektrospray – Ionisation (MALDESI) ist ein Beispiel für solche Verfahren, in denen Merkmale der Matrix-unterstützte Laser – Desorption / Ionisation (MALDI) (zB gepulste Art der Desorption) und Elektrospray – Ionisation (ESI) (zB Soft Ionisierung ) kombiniert werden. Einer der wichtigsten Vorteile der MALDESI ist die inhärente Variabilität. In MALDESI Experimenten eine Ultraviolett (UV) oder Infrarot (IR) -Laser kann auf resonant eine endogene oder exogene Matrix erregt verwendet werden. Die Wahl der Matrix ist nicht Analyten abhängig und hängt allein von der Laserwellenlänge zur Anregung verwendet. In IR-MALDESI Experimenten wird eine dünne Eisschicht auf der Probenoberfläche als eine energieabsorbierende Matrix abgeschieden. Die IR-MALDESI Quellengeometrie wurde für die Analyse von flüssigen Proben sowie biol mittels statistischer Versuchsplanung (DOE) optimiertlogischen Gewebeproben. Weiterhin wurde eine robuste IR-MALDESI Abbildungsquelle entwickelt, bei denen ein abstimmbarer mid-IR-Laser wird mit einem computergesteuerten XY-Translationsstufe und ein hohes Auflösungsvermögen Massenspektrometers synchronisiert. Eine angepasste grafische Benutzeroberfläche (GUI) Benutzerauswahl der Repetitionsrate des Lasers, die Anzahl der Aufnahmen pro Voxel, Schrittgröße der Probe Bühne, und die Verzögerung zwischen der Desorption und Scan-Ereignisse für die Quelle erlaubt. IR-MALDESI wurde in einer Vielzahl von Anwendungen, wie forensische Analyse von Fasern und Farbstoffe und MSI von biologischen Gewebeschnitten verwendet. Verteilung verschiedener Analyten aus endogenen Metaboliten exogene Xenobiotika in Gewebeschnitten im Bereich kann mit dieser Technik gemessen und quantifiziert werden. Das Protokoll in diesem Manuskript präsentiert beschreibt wichtige Schritte, die für IR-MALDESI MSI von Ganzkörpergewebeschnitten.
Introduction
Massenspektrometrie imaging (MSI) in Mikro Modus beinhaltet Desorption der Probe von einer Oberfläche durch einen Strahl (Laser oder Ionen) an diskreten Stellen über die Oberfläche einer Probe. An jedem Rasterpunkt wird ein Massenspektrum erzeugt, und die erfassten Spektren, zusammen mit den räumlichen Standort, von dem sie gesammelt wurden, können gleichzeitig verwendet werden, um zahlreiche Analyten in der Probe abzubilden. Diese markierungsfreie Art und Weise der Bildgebung auf die Sensitivität und Spezifität der Massenspektrometrie gekoppelt haben MSI einer der am schnellsten entwickelnden Felder in der Massenspektrometrie 1,2 verhalf.
Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation (MALDI) ist die häufigste Ionisationsverfahren verwendet für MSI analysiert. Jedoch stellen die Notwendigkeit einer organischen Matrix und die Vakuumanforderungen von MALDI erhebliche Einschränkungen auf Reproduzierbarkeit, Probendurchsatz und die Arten von Proben, die unter Verwendung des Verfahrens analysiert werden kann. Eine Reihe von Atmosphärendruck (AP) iosation Verfahren wurden in den letzten Jahren entwickelt , um diese Beschränkungen 3 zu umgehen. Diese Umgebungs Ionisierungsmethoden ermöglichen die Analyse von biologischen Proben in einer Umgebung, die viel näher an ihrem natürlichen Zustand ist und Probenvorbereitungsschritte vor der Analyse zu vereinfachen. Matrix-unterstützte Laser – Desorption Elektrospray – Ionisation (MALDESI) ist ein Beispiel eines solchen Ionisationsverfahren 4,5.
In IR-MALDESI Experimenten wird eine dünne Eisschicht auf der Gewebeoberfläche als energieabsorbierende Matrix abgeschieden. A mid-IR-Laserpuls wird durch das Eis-Matrix absorbiert wird, und erleichtert die Desorption von neutralen Materialien von der Oberfläche durch resonant Erregen der OH-Streckschwingung von Wasser. Das desorbierte Neutralen Trennwand in die geladenen Tröpfchen eines orthogonalen Elektrospray- und sind post-ionisiert in einer ESI artig 4-6. Die Zugabe von exogenen Eismatrix wird bevorzugt über allein auf dem endogenen Wasser im Gewebe zu verlassen, da es ac hilftzählen für Variationen des Wassergehalts in verschiedenen Gewebekammern und gezeigt wurde von ~ 15-fach 7,8 in Gewebeabbildungsexperimenten Desorption 6 und verbessern Ionenabundanz zu verbessern.
In dieser Arbeit verwenden wir IR-MALDESI MSI die Verteilung von Metaboliten in den verschiedenen Organen in einem neugeborenen Maus ganzen Körper zu entlocken. Eine Übersicht der einstellbaren Parameter des IR-MALDESI Quelle gegeben ist, und die notwendigen Schritte für die erfolgreiche Bildgebung von Gewebeschnitten demonstriert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll über beschreibt die wichtigsten Schritte zur Durchführung eines IR-MALDESI MSI Experiment. Die Matrix Bewerbungsverfahren (Abschnitt 3) dauert ca. 20 min, die für die MALDI-MSI-Experimente durch Sublimation oder Sprühbeschichten mit einem Roboter-Sprayer auf eine typische Matrix Bewerbungsverfahren ähnlich ist. Darüber hinaus IR-MALDESI beruht nicht auf Partitionierung von Analyten in die Matrixkristalle 6 und die Eis – Matrix kann universell für alle Analyten unabhängig von ihrer Masse,…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Professor H. Troy Ghashghaei from NCSU Department of Molecular Biomedical Sciences for providing the whole mouse tissue. The authors also gratefully acknowledge the financial assistance received from National Institutes of Health (R01GM087964), the W.M. Keck foundation, and North Carolina State University.
Materials
| IR-MALDESI Source | Custom-made | N/A | Please refer to references 4 and 12 for an in-depth discussion of IR-MALDESI source development. |
| Q Exactive Plus | Thermo Scientific | Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | |
| Water, HPLC Grade | Burdick & Jackson | AH365-4 | |
| Methanol, HPLC Grade | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 56302 | |
| Tunable mid-IR Laser | Opotek Inc. | IR Opolette | Tunable 2700-3100 nm IR OPO laser |
| Nitrogen Gas | Arc3 Gases | AG S-NI300-5.0 | Grade 5.0 high purity nitrogen gas cylinder (300) |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM 1950 | Cryomicrotome |
| High Profile Microtome Blades | Leica Biosystems | 3802123 | Leica DB80HS |
| Mounting Medium (OCT) | Leica Biosystems | 3801480 | Surgipath FSC 22 mounting medium |
| Cryostat Specimen Disc | Leica Biosystems | 14047740045 | 40 mm diameter |
| Glass Microscope Slides | VWR | 48312-003 | Frosted, selected, pre-cleaned |
Referenzen
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