Metodi per studiare Mrp4 contenenti complessi macromolecolari nel regolamento di Fibroblasto migrazione
Summary
MRP4 regola varie ciclici eventi di segnalazione nucleotidi-dipendenti, tra cui un ruolo di recente chiarito nella migrazione cellulare. Descriviamo un approccio diretto, ma multiforme per svelare i bersagli molecolari a valle di MRP4 con conseguente identificazione di un interattoma MRP4 unico che gioca un ruolo chiave nella regolazione messa a punto della migrazione dei fibroblasti.
Abstract
multidrug resistance proteina 4 (MRP4) è un membro della famiglia ATP-binding cassette di trasportatori di membrana ed è un trasportatore di efflusso endogena di nucleotidi ciclici. Modulando la concentrazione intracellulare di nucleotidi ciclici, MRP4 in grado di regolare molteplici eventi cellulari nucleotide-dipendente ciclici, tra cui la migrazione delle cellule. In precedenza, abbiamo dimostrato che, in assenza di MRP4, cellule di fibroblasti contengono livelli più elevati di nucleotidi ciclici intracellulari e possono migrare velocemente. Per comprendere i meccanismi alla base di questo risultato, abbiamo adottato un approccio diretto ma multiforme. In primo luogo, abbiamo isolato potenziali complessi proteici interagenti di MRP4 da un sistema di celle MRP4 sovraespressione usando immunoprecipitazione seguita da spettrometria di massa. Dopo aver identificato le proteine uniche nel interattoma MRP4, abbiamo utilizzato Ingenuity Pathway Analysis (IPA) per esplorare il ruolo di queste interazioni proteina-proteina nel contesto di trasduzione del segnale. Abbiamo chiarito il Poil ruolo ziale del complesso proteico MRP4 nella migrazione cellulare e identificato F-actina come un importante mediatore degli effetti della MRP4 sulla migrazione delle cellule. Questo studio ha anche sottolineato il ruolo di cAMP e cGMP come protagonisti i fenomeni migratori. Utilizzando ad alta contenuto di microscopia, abbiamo eseguito test cell-migrazione e osservato che l'effetto di MRP4 sulla migrazione dei fibroblasti è completamente abolita dalla rottura del citoscheletro o l'inibizione di cAMP-dipendente chinasi A (PKA). Per visualizzare segnalazione modulazioni in una cella migrazione in tempo reale, abbiamo utilizzato un sensore FRET-based per misurare l'attività PKA e trovato, la presenza di attività più polarizzata PKA in prossimità del bordo anteriore della migrazione Mrp4 – / – fibroblasti, rispetto al Mrp4 + / + fibroblasti. Questo a sua volta aumenta la formazione di actina corticale e aumentato il processo di migrazione. Il nostro approccio consente di identificare le proteine che agiscono a valle di MRP4 e ci fornisce un overvista del meccanismo coinvolto nella regolazione MRP4-dipendente della migrazione dei fibroblasti.
Introduction
la migrazione delle cellule è un complicato processo multi-step. Studi hanno dimostrato che durante cellule migrazione sono polarizzati in salita e di discesa. Aderendo alla matrice extracellulare, il bordo anteriore fornisce la trazione necessaria per il corpo cellulare di andare avanti. Infine, le finali rilascia bordo attacchi posteriori e completa il ciclo di 1,2 migrazione.
la polarizzazione delle cellule per la migrazione delle cellule efficiente è regolata dalla segregazione spaziale di segnalazione intracellulare. Cellular secondi messaggeri, come campo, mediano la compartimentazione degli eventi di segnalazione necessari per la messa a punto 3,4 migrazione delle cellule direzionale. Accumuli preferenziali di cAMP e cAMP-dipendente chinasi attività PKA all'avanguardia giocano un ruolo chiave nella migrazione delle cellule direzionale 5,6. Fosforilando piccole GTPasi come Ras legati substrato C3 tossina botulinica (Rac) e il controllo della divisione cellulare della proteina 42 omologo o Cdc42, PKA attiva actina-related protein 2/3 (Arp 2/3) all'avanguardia e induce la formazione di lamellipodi 7-9. PKA fosforila anche un agente anti-capping, vasodilatatore stimolato fosfoproteina (VASP), regola in tal modo i cicli oscillatori di estensione della membrana e retrazione 10,11.
Nelle cellule, i livelli di cAMP sono regolati da tre grandi processi: i) sintesi di ciclasi, ii) la degradazione da fosfodiesterasi, e iii) il trasporto da parte dei trasportatori di efflusso di membrana 3. Multidrug proteina resistenza 4 (MRP4), un membro della ATP-binding cassette (ABC) famiglia di trasportatori di membrana, funziona come un trasportatore d'efflusso endogena di nucleotidi ciclici. Pertanto, MRP4 può regolare i livelli intracellulari di cAMP e cAMP-dipendente cellulare segnalazione 11-13. Abbiamo precedentemente dimostrato che in Mrp4 – / -, fibroblasti contengono livelli relativamente elevati di nucleotidi ciclici e migrare più velocemente compared a Mrp4 + / + 14 fibroblasti. Abbiamo inoltre riportato un effetto bifasico di nucleotidi ciclici sulla migrazione dei fibroblasti. Sulla base di studi precedenti e la nostra scoperta che Mrp4 – / – fibroblasti contiene cAMP più polarizzata nel corso della migrazione, abbiamo ipotizzato che questo regolamento MRP4-mediata della migrazione dei fibroblasti è cAMP dipendente. Al fine di comprendere il meccanismo a valle, abbiamo preso un approccio diretto ma multiforme.
Per identificare le proteine associate e in interazione con MRP4, abbiamo immunoprecipitati MRP4 contenenti complessi macromolecolari a partire da cellule HEK293 che oltre esprimono MRP4. Utilizzando la spettrometria di massa, abbiamo identificato più proteine MRP4 interagenti e analizzato la loro interconnettività con Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA è uno strumento utile per analizzare le interazioni proteina-proteina (sia strutturali e funzionali) ed esplorare il loro contributo, in particolare, fisiologica e patologicaeventi in base alla letteratura e evidenze sperimentali 15,16. IPA indicato che F-actina è un obiettivo importante valle MRP4 nel contesto della migrazione cellulare dove cAMP e cGMP sono la chiave molecole di segnalazione 17. Questi dati sono stati ulteriormente confermati mediante microscopia ad alta contenuto. -Alto contenuto di microscopia in grado di catturare e analizzare i comportamenti delle cellule, come la migrazione delle cellule in un più comodo, preciso e high-throughput modo 18. I dati ad alto contenuto di microscopia dimostrato che l'effetto di MRP4 sulla migrazione dei fibroblasti è completamente abolita in perturbazioni del citoscheletro actina o inibizione della PKA 17.
Inoltre, abbiamo usato un Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) a base di sensore PKA di monitorare le dinamiche PKA nella migrazione delle cellule in tempo reale. I sensori chinasi FRET-based di solito consistono in specifici peptidi substrato di fosforilazione affiancato da PCP e fluorofori YFP 19-21. pmAKAR3 è un migliorato e mimbrane mirato sensore PKA FRET-based che contiene dominio forkhead-associato 1 (FHA1) e la sequenza PKA substrato LRRATLVD 5,22. La fosforilazione di pmAKAR3 dalle PKA aumenta subunità catalitica FRET segnale tra CFP e YFP 19. Inserimento di un dominio modifica lipidi nel sensore rivolge alla membrana plasmatica di monitoraggio dinamiche PKA, specificamente al vano membrana 23.
Utilizzando pmAKAR3, abbiamo dimostrato che il bordo iniziale della migrazione Mrp4 – / – fibroblasti esposti più polarizzata attività PKA di Mrp4 + / + fibroblasti, che a loro volta aumentano la formazione actina corticale a bordo di entrata della cella 17. Insieme, questi eventi comportato una migliore polarizzazione cellulare e la migrazione delle cellule più veloce direzionale in assenza di MRP4. Il nostro approccio specifico e diretto identificato bersagli a valle chiave per MRP4 e fornisce un importante, ma comedell'ennesima meccanismo di inesplorato per la regolazione MRP4-dipendente della migrazione dei fibroblasti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35-mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
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