Cicloheximida Análise perseguição de degradação da proteína em<em> Saccharomyces cerevisiae</em

Summary

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Abstract

Regulamento da abundância de proteína é crucial para praticamente todos os processos celulares. abundância proteína reflecte a integração das taxas de síntese de proteínas e a degradação da proteína. Muitos ensaios de relatórios sobre a abundância de proteínas (por exemplo, em tempo único ponto de transferência de Western, citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, ou os ensaios reporter baseados em crescimento) não permitem discriminação dos efeitos relativos de tradução e proteólise nos níveis de proteína. Este artigo descreve a utilização de ciclo-heximida perseguição seguido de western blotting para analisar a degradação de proteínas especificamente no eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levedura de germinação). Neste procedimento, as células de levedura são incubadas na presença do inibidor de ciclo-heximida translacional. Alíquotas de células são recolhidas e imediatamente depois em pontos de tempo específicos seguintes adição de ciclo-heximida. As células são lisadas e os lisados ​​são separados por electroforese em gel de poliacrilamida for análise de Western blot de proteínas de abundância em cada ponto de tempo. O procedimento de ciclo-heximida perseguição permite a visualização da cinética de degradação da população do estado estacionário de uma variedade de proteínas celulares. O procedimento pode ser utilizado para investigar os requisitos para genéticos e influências ambientais sobre a degradação da proteína.

Introduction

Proteínas executar funções cruciais em praticamente todos os processos celulares. Muitos processos fisiológicos requerem a presença de uma proteína específica (ou proteínas) por um período de tempo definido, ou sob circunstâncias particulares. Organismos, portanto, monitorar e regular a abundância de proteína para atender às necessidades celulares ^1. Por exemplo, as ciclinas (proteínas que controlam a divisão celular) estão presentes em fases específicas do ciclo celular, e a perda dos níveis de ciclina regulamentados tem sido associada com a formação do tumor maligno ^2. Além de regular os níveis de proteína para satisfazer as necessidades celulares, células empregam mecanismos de controlo de qualidade degradativas para eliminar deformadas, as moléculas de proteína não montadas, ou de outro modo aberrantes ^3. Controle de abundância de proteína envolve regulação tanto a síntese macromolecular (transcrição e tradução) e degradação (decomposição RNA e proteólise). a degradação da proteína deficiente ou excessiva contribui para várias patologias, Incluindo o cancro, fibrose cística, doenças neurodegenerativas, e desordens cardiovasculares ^4-8. Mecanismos proteolíticas, portanto, representam alvos terapêuticos promissores para uma série de doenças ^9-12.

Análise de proteínas em um único ponto do tempo (por exemplo, por western blot ^13, citometria de fluxo ^14, ou microscopia de fluorescência ¹⁵⁾ fornece um instantâneo da abundância de proteína em estado estacionário, sem revelar as contribuições relativas de síntese ou degradação. Da mesma forma, ensaios repórter baseada em crescimento reflectem os níveis de proteína em estado estacionário durante um período de tempo prolongado sem discriminar entre as influências de síntese e degradação ^15-20. É possível inferir a contribuição dos processos de degradação para os níveis de proteína em estado estacionário, comparando abundância antes e depois de inibir componentes específicos do mecanismo de degradação (por exemplo, por farmacologicamente inactiva o proteasome ²¹ ou batendo para fora um gene a hipótese de ser necessário para a degradação ^13). Uma alteração nos níveis de proteína em estado estacionário após a inibição das vias degradativas proporciona forte evidência para a contribuição de proteólise para o controlo da abundância de proteína ^13. No entanto, essa análise ainda não fornece informações sobre a cinética de retorno da proteína. Chase Cycloheximide seguida por western blot supera essas deficiências, permitindo que os investigadores para visualizar a degradação da proteína ao longo do tempo ^22-24. Além disso, porque a detecção da proteína seguinte perseguição ciclo-heximida é tipicamente realizada por Western blotting, isótopos radioactivos e passos morosos imunoprecipitação não são necessários para a perseguição ciclo-heximida, ao contrário de muitas técnicas de pesquisa por pulso habitualmente utilizados, que são também realizados para visualizar a degradação da proteína ^{de 25.}

Ciclo-heximida foi pela primeira vez identificado como um composto com anti-fúngica adequadalaços produzidos por Streptomyces bactéria gram-positiva griseus ^26,27. É uma molécula de células-permeável que inibe especificamente citosólica eucariótica (mas não organelar) por tradução ribossomal prejudicando translocação ^28-31. Numa experiência cicloheximida Chase, ciclo-heximida é adicionado às células, e as alíquotas de células são recolhidas e imediatamente em pontos de tempo específicos após a adição do composto ^22. As células são lisadas, e a abundância de proteína em cada ponto de tempo é analisado, tipicamente por western blot. Diminuições na abundância de proteínas após a adição de ciclo-heximida pode ser com confiança atribuídos a degradação da proteína. Uma proteína instável vai diminuir em abundância ao longo do tempo, enquanto que uma proteína relativamente estável irá apresentar pouca mudança em abundância.

Os mecanismos de degradação de proteínas selectiva têm sido altamente conservadas ao longo da Eukarya. Muito do que se sabe sobre a degradação das proteínas foi aprendido pela primeira vez emo eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levedura de brotamento) ^25,32-36. Estudos com levedura tendem a continuar fornecendo insights novos e importantes para a degradação de proteínas. Um método para a perseguição de ciclo-heximida em células de levedura, seguido de análise Western blot de proteínas de abundância é aqui apresentada.

Protocol

1. Crescimento e colheita de células de levedura Se não análise cinética de degradação de uma proteína de levedura endógena, transformar a estirpe (s) desejado levedura com um plasmídeo que codifica para a proteína de interesse. Métodos fiáveis ​​para a transformação de leveduras foram previamente descrito 37. Inocular levedura em 5 ml de meio apropriado (por exemplo, definida SD) meio selectivo sintético (para manutenção de plasmídeo de células transformad…

Representative Results

Para ilustrar cicloheximida metodologia perseguição, a estabilidade de Deg1 -Sec62 (Figura 1), uma degradação -associated (ERAD) substrato modelo de levedura retículo endoplasmático (ER), foi analisada 42-44. Em ERAD, de controlo de qualidade enzimas ubiquitina ligase covalentemente atribuem cadeias da pequena proteína de ubiquitina para as proteínas aberrantes localizadas à membrana do RE. Tais proteínas polyubiquitylated são subsequenteme…

Discussion

Neste trabalho, um método para a análise cinética de degradação da proteína é apresentada. Esta técnica pode ser facilmente aplicado a uma variedade de proteínas degradadas por uma variedade de mecanismos. É importante notar que os ensaios de ciclo-heximida chase informar sobre a cinética de degradação de piscina de estado estacionário de uma dada proteína. Outras técnicas podem ser usadas para analisar a cinética de degradação de populações específicas de proteínas. Por exemplo, o destino de degr…

Materials

Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes	Fisher Scientific	14-961-32	Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)	Dot Scientific	51028068	Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)	New Brunswick	M1053-0450	A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H	New Brunswick	M1053-4004	For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430	Eppendorf	5427 000.216	Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place	Eppendorf	F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene	Sarstedt	62.554.205	Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes	Eppendorf	22364120	Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters	Fisher Scientific	1172011AQ	It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15-ml conical tubes	Fisher Scientific	11-473-70	For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubes	Fisher Scientific	11-718-9Q	For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane			Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)	Li-Cor	9140-01	Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes	Fisher Scientific	IPFL00010	Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))	Life Technologies	459250	Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))	Life Technologies	A-21065	Will vary by lab and application