זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול
Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ multiphoton לבצע הדמית הזמן לשגות מורחבת של אינטראקציות רבות-תאי בזמן אמת, in vivo ברזולוצית תא בודד.
Abstract
In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.
Introduction
הפצת תאים סרטניים מגידול החלב הראשוני הוכחה לערב תאים סרטניים רק לא, אבל לארח תאי סטרומה כוללים מקרופאגים ותאי האנדותל. יתר על כן, בכלי הדם של הגידול הוא לא נורמלי עם חדירות מוגברת 1. לפיכך, קביעת האופן שבו תאים סרטניים, מקרופאגים ותאי האנדותל אינטראקציה לתווך חדירות כלי הדם ואת intravasation תאים סרטניים ב במיקרו-סביבה של הגידול הראשוני הוא חשוב עבור גרורות הבנה. הבנת קינטיקה של חדירות כלי דם, intravasation תאים סרטניים ואת מנגנון האיתות הבסיסי של אינטראקציות רבות-תאי ב microenvironment הגידול יכול לספק מידע חיוני בדבר ההתפתחות והמנהל של טיפולים אנטי סרטניים.
האמצעי העיקרי של לימוד חדירות כלי הדם הגידול in vivo כבר למדידת צבעים extravascular כגון אוונס 2 כחול, dextrans משקל מולקולרי גבוה (155 KDA)3 ו fluorophore או חלבונים מצומדות radiotracer (כולל אלבומין) 4 בנקודות זמן קבוע לאחר ההזרקה של צבע. התקדמויות מיקרוסקופיה, במודלים של בעלי חיים ו צבעי ניאון אפשרו הדמיה של תהליכים תאיים ו חדירות כלי הדם בבעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ intravital 5.
הדמיה חייה עם רכישת תמונות סטטיות, או רצפי זמן לשגות קצר על מספר נקודות זמן אינה מאפשרת ההבנה המלאה של אירועים דינמיים במייקרו-הסביבה של גידול 6,7. אכן, רכישת תמונה סטטית במשך 24 שעות הראו כי בכלי הדם של הגידול הוא דולף, אולם הדינמיקה של חדירות כלי הדם לא נצפתה 6. לפיכך, זמן לשגות הדמיה רציפה המורחבת עד 12 שעות לוכדת את קינטיקה של אירועים דינמי במיקרו-סביבה של הגידול.
פרוטוקול זה מתאר את השימוש multiphot זמן לשגות המורחבתעל מיקרוסקופיה intravital ללמוד אירועים רב-תאיים דינמי במיקרו-סביבה של הגידול. סוגי תאים מרובים במיקרו-סביבה של הגידול מסומנים עם צבעי בזריקות או באמצעות חיות טרנסגניות להביע חלבוני ניאון. באמצעות קטטר וריד זנב צבעי כלי דם או חלבונים ניתן להזריק לאחר תחילת הדמיה לרכוש נתונים הקינטית של אירועים רבים-תאי ב microenvironment הגידול. עבור הדמית תא חי גידול החלב חשוף תוך הכנת הכירורגית של דש עור. תמונות נרכשות עבור עד 12 שעות באמצעות מיקרוסקופ multiphoton מצויד צינורות מכפיל מרובים (PMT) גלאי 8. באמצעות מסננים מתאימים, אלגוריתם חיסור מאפשרת 4 גלאי PMT לרכוש 5 אותות ניאון במיקרו-סביבה של הגידול בו זמנית 9. מיקרוסקופיה intravital multiphoton ברזולוציה גבוהה לוכדת הדמיה ברזולוציה תא בודד של אינטראקציות גידולים stroma ב במיקרו-סביבה של הגידול, מה שמוביל טוב understanding של חדירות כלי הדם תאים סרטניים intravasation 10-13. באופן ספציפי, חשף הדמית intravital מורחב מקומי מאוד, אירועים חדירים כלי דם חולפים המתרחשים באופן סלקטיבי באתרים של אינטראקציה בין תאים סרטניים, מקרופאג ו תא האנדותל (מוגדר כגידול microenvironment של גרורה, TMEM 14) 13. יתר על כן, intravasation תאים סרטניים מתרחש רק TMEM והוא במרחב ובזמן בקורלציה עם חדירות כלי דם 13. ברזולוציה תא בודד של הדינמיקה של האירועים הללו התאפשרה באמצעות מיקרוסקופיה multiphoton זמן לשגות המורחבת של תאים שכותרתו fluorescently ב במיקרו-סביבה של הגידול.
Protocol
Representative Results
Discussion
אינטראקציות הסלולר המתרחשות באופן ספונטני במיקרו-סביבה של הגידול יכול להביא לשינויים תנועתיות התא הגידול intravasation. הדמית intravital ברזולוציה גבוהה של רקמת גידול חייה מאפשרת ההדמיה של דינמיקה רבה תאית שיכול להיות 10,13,24 חולף מאוד. סוף-טעם מבחני vivo או זמן לשג…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי שד משרד ההגנה Cancer Research Program תחת מספר הפרסים (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, PPG CA100324, ותכנית ההדמיה המשולבת.
Materials
| 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/mL in 1 X PBS |
| 70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/mL in 1 X PBS |
| 10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/mL in 1 X PBS |
| Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 uL in 175 uL of 1 X PBS for injection |
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
| Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 1 x PBS | Life Technologies | ||
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 mL |
| Oxygen | AirTech | ||
| 1 mL syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
| 30G x 1 (0.3 mm X 25 mm) needle | BD | 305128 | |
| Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. X 0.64 mm O.D. |
| Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 X 50 mm |
| MouseOx oximeter, software and sensors | STARR Life Sciences | ||
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
| hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" X 12", 50A Durometer, |
| Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20x 1.05NA objective lens. | |
| 7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | , 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch, |
Referenzen
- Gerlowski, L. E., Jain, R. K. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues. Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).
- Wang, H. -. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, (2014).
- Dvorak, H. F. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).
- Nagy, J. A., et al. Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A. Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, (2013).
- Yuan, F., et al. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).
- Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA). Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), (2013).
- Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis. J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).
- Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J. High-Resolution Multiphoton Imaging of Tumors. In Vivo. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2011).
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6 (9), e24807 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).
- Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Yano, S., et al. Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness. Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).
- Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time. Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).
- Manning, C. S., et al. Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib. Intravital. 2 (1), 24790 (2013).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Brown, E. B., et al. In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).
