JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Automatische Übersetzung
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biotechnik

Rapid Scan Electron Paramagnetische Resonantie opent nieuwe wegen voor Imaging Fysiologisch belangrijke parameters<em> In Vivo</em

Published: September 26, 2016
doi:
10.3791/54068
, , , , , , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of Denver, 2Magnetic Imaging Group, Applied Physics Division, Physical Measurements Laboratory,National Institute of Standards and Technology, 3Department of Radiology, Geisel School of Medicine,Dartmouth University, 4Department of Biochemistry,West Virginia University, 5Department of Electrical and Computer Engineering,University of Denver, 6Department of Engineering,University of Denver

Summary

Een methode nieuwe elektronen paramagnetische resonantie (EPR), een snelle scan EPR (RS-EPR), is aangetoond voor 2D spectrale ruimtelijke beeldvorming die superieur is aan de traditionele continue golf (CW) techniek en opent nieuwe locaties voor in vivo beeldvorming. Resultaten worden gedemonstreerd op 250 MHz, maar de techniek is toepasbaar bij een bepaalde frequentie.

Abstract

We tonen een superieure methode van 2D spectrale en ruimtelijke beeldvorming van stabiele radicaal reporter moleculen aan 250 MHz met behulp van rapid-scan elektronen-paramagnetische-resonantie (RS-EPR), die kwantitatieve informatie kunnen verschaffen onder in vivo omstandigheden op zuurstofconcentratie, pH, redox status en de concentratie van signaalmoleculen (dat wil zeggen, OH •, NO •). De RS-EPR techniek heeft een hogere gevoeligheid, een betere ruimtelijke resolutie (1 mm) en kortere acquisitietijd in vergelijking met de standaard continue golf (CW) techniek. Verschillende fantoom configuraties zijn getest met ruimtelijke resolutie variërend van 1 tot 6 mm en spectrale breedte van de reporter moleculen varieert van 16 pT (160 mg) teneinde 5 mT (50 G). Een cross-loop bimodale resonator ontkoppelt excitatie en detectie, het verminderen van het lawaai, terwijl de snelle scan effect zorgt voor meer macht om input voor de spin-systeem voor verzadiging, het verhogen van de EPR-signaal. Dezeleidt tot een aanzienlijk hogere signaal-ruisverhouding dan bij gebruikelijke CW EPR experimenten.

Introduction

Ten opzichte van andere medische beeldvormende technieken, elektronen paramagnetische resonantie imaging (EPRI) is bij uitstek in staat om beeld kwantitatief fysiologische eigenschappen, waaronder pH 1-3, PO 04-07 februari, temperatuur 8, perfusie en levensvatbaarheid van de weefsels 9, microviscositeit en het gemak van de verspreiding van kleine moleculen 10 en 11 oxidatieve stress. Schatting van het gemak van disulfide splitsing door glutathion (GSH) in het weefsel en cellen 12,13 kunnen rapporteren over redox status. Voor in vivo beeldvorming, EPR in het frequentiegebied tussen de 250 MHz en 1 GHz is gekozen omdat deze frequenties voldoende diepte van penetratie (tot enkele cm) om beelden voor kleine dieren waarbij intensiteiten niet worden verminderd door diëlektrische effecten genereren. Hogere frequenties, zoals 9,5 GHz 14 (X-band) en 17 GHz (K u -band) 15,16 kan worden gebruikt voor beeldvorming van huid en haar of enkele cellenRespectievelijk. Het succes van EPRI bij alle frequenties afhankelijk paramagnetische rotatie probes die specifiek zijn voor weefsels zodat hun locatie en het lot kan worden afgebeeld zijn.

Als de omgeving van een elektronenspin probe is ruimtelijk heterogeen, de EPR-spectrum is de som van de bijdragen van alle locaties. Spectrale en ruimtelijke beeldvorming verdeelt volume monster in een array van kleine ruimtelijke segmenten en berekent de EPR spectrum voor elk van deze segmenten 17. Hierdoor kan in kaart brengen van de lokale omgeving door meting van de ruimtelijke variatie in de EPR-spectrum. Magnetische veldgradiënten worden gebruikt om ruimtelijke informatie in EPR-spectra, die uitsteeksels genoemd coderen. Het beeld spectrale en ruimtelijke wordt gereconstrueerd uit deze projecties 18,19.

RS-EPR het magneetveld wordt afgetast door middel van resonantie in een tijd die kort is ten opzichte van electron spin-relaxatietijden (figuur 2) 20,21. D econvolution de snelle-aftastsignaal geeft het absorptiespectrum, wat overeenkomt met de eerste integraal van de conventionele eerste afgeleide spectrum CW. De snelle scan-signaal gedetecteerd in kwadratuur, zodat zowel absorptie en dispersie componenten van het spinsysteem respons gemeten. Dit is hoofdzakelijk het verzamelen tweemaal de hoeveelheid data per tijdseenheid. Verzadiging van het signaal in een snelle scan experiment gebeurt bij hogere vermogens dan CW, zodat hogere krachten kunnen worden gebruikt zonder zorg voor verzadiging. 20,22 Veel meer kan gemiddelden per tijdseenheid worden uitgevoerd in vergelijking met CW. Hoger vermogen, kwadratuurdetektie en gemiddelden per tijdseenheid combineren om een ​​snelle scan een betere signaal-ruisverhouding (SNR), vooral bij hoge gradiënt projecties die ruimtelijke scheiding definiëren, waardoor beelden met hogere kwaliteit. Bereiken ongeveer dezelfde SNR voor een afbeelding van een fantoom vereist ongeveer 10 keer zo lang voor CW als snelle scan 23.

tent "> De verhoogde SNR laat ook experimenten bij 250 MHz met lage concentratie rotatie houden adducten gevormd door de reactie van OH met 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline- N-oxide (BMPO-OH) middelen die zijn onzichtbaar voor de CW methode 24. Dinitroxides verbonden met een disulfide linker gevoelig voor splitsing door glutathion, en dus kunnen over cellulaire redox status. Equilibrium bestaat, afhankelijk van de concentratie van glutathion aanwezig tussen de di- en mono-groep vormen. het observeren van deze veranderingen vereist vangst van de gehele 5 mT breed spectrum, en kan veel sneller worden bereikt met een snelle scan EPR in vergelijking met de intensivering van het magnetische veld in een CW experiment.

Een compleet snelle scan systeem bestaat uit vier delen: de spectrometer, het hoofdveld magneet, de snelle scan coil driver, en de snelle scan cross-lus resonator. De spectrometer en het hoofdveld magneet werken op dezelfde als in een CW experiment, waarin het belangrijkste gebied Zeemanen die de gegevens van de resonator. De snelle scan spoel driver genereert de sinusvormige scan stroom die gaat in speciaal ontworpen snelle scan spoelen van de snelle scan cross-lus resonator. De snelle scan spoelen van de snelle scan cross-lus resonator genereren grote homogeen magnetisch veld, dat wordt doorlopen bij frequenties tussen 3 en 15 kHz.

Protocol

1. Instelling van het Rapid Scan Coil Driver bij 250 MHz Berekening van Rapid Scan experimentele omstandigheden Opmerking: De belangrijkste parameter in RS-EPR is scansnelheid, α, die het product van scanfrequentie en scanbreedte (vergelijking 3). Voor smalle scan breedtes, sneller scan gehanteerde tarieven, en voor een bredere veegbreedtes, zijn langzamer scansnelheden gebruikt. De volgende instructies stap voor stap door het laatste geval en laten zien hoe om te komen tot de experim…

Representative Results

Het product van het experiment is een set uitsteeksels die in twee-dimensionale (één spectraal, een ruimtelijke) beelden worden gereconstrueerd met een valse kleur schaal signaalamplitude vertegenwoordigen. Diepblauwe geeft basislijn, waar geen signaal aanwezig is, groen is laag amplitude en rood is de hoogste. Segmenten langs de x-as (spectrale dimensie) tonen het signaal EPR (EPR transitie) op een magnetisch veld as. Langs de y-as (ruimtelijke dimensie), scheiding tussen signalen kom…

Discussion

Rapid-aftastsignalen hogere frequentiecomponenten dan CW, en vereisen een grotere bandbreedte resonator afhankelijk lijnbreedten, relaxatietijd en de snelheid van de snelle-scans. Die bandbreedte voor een gegeven experiment is gebaseerd op de lijnbreedte en de scansnelheid van het magnetische veld (Vergelijking 2). Afhankelijk van de relaxatietijden van de sonde bestudeerde (T2 en 2 *) en de scansnelheid, kunnen oscillaties op de achterflank van het signaal. Voor nitroxide radicalen met T 2</s…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gedeeltelijke ondersteuning van dit werk door de NIH subsidies NIBIB EB002807 en CA177744 (GRE en SSE) en P41 EB002034 om GRE, Howard J. Halpern, PI, en door de Universiteit van Denver is dankbaar erkend. Mark Tseytlin werd ondersteund door NIH R21 EB022775, NIH K25 EB016040, NIH / NIGMS U54GM104942. De auteurs zijn dankbaar Valery Khramtsov, nu aan de Universiteit van West Virginia, en Illirian Dhimitruka aan de Ohio State University voor de synthese van de pH-gevoelige TAM radicalen, en Gerald Rosen en Joseph Kao aan de Universiteit van Maryland voor de synthese van de mHCTPO , PROXYL, BMPO en nitronyl radicalen.

Materials

4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperdinyloxyl (15N PDT) CDN Isotopes  M-2327 98% atom 15N, 98 % atom D, Quebec Canada
4-1H-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-3-pyrrolinyloxyl (15N mHCTPO) N/A N/A Synthesized at U.Maryland and described in Reference 29
3-carboxy-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-1-(3,4,4-2H3,1-15N)pyrrolidinyloxyl (15N Proxyl) N/A N/A Synthesized at U.Maryland and described in reference 25
4 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass 707-SQ-100M
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4)piperdinyloxyl (14N PDT) CDN Isotopes D-2328 98% atom D, Quebec Canada
pH sensitive trityl radical (aTAM4) Ohio State University N/A Synthesized at Ohio State University and described in reference 26
Potassum Phosphate, Monobasic J.T. Baker Chemicals 1-3246
6 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-5M-6M-0-250/RB
8 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-7M-8M-0-250/RB
5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide (BMPO)  N/A N/A Synthesized at U.Maryland and described in reference 30
Hydrogen Peroxide Sigma Aldrich H1009 SIGMA 30%
16 mm Quartz EPR tube Wilmad Glass 16-7PP-11QTZ
Medium Pressure 450 W UV lamp Hanovia 679-A36 Fairfield, NJ
L-Glutathione, reduced Sigma Aldrich G470-5
Nitronyl NA N/A Synthesized at U.Maryland and described in reference 31
Sodium Hydroxide  J.T. Baker Chemicals 1-3146
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn. Reson. Med. 67 (6), 1827-1836 (2012).
  2. Utsumi, H., et al. Simultaneous molecular imaging of redox reactions monitored by overhauser-enhanced MRI with 14N-and 15N-labeled nitroxyl radicals. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1463-1468 (2006).
  3. Khramtsov, V. V., Grigor’ev, I. A., Foster, M. A., Lurie, D. J., Nicholson, I. Biological applications of spin pH probes. Cell. Mol. Bio. 46 (8), 1361-1374 (2000).
  4. Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic Resonance. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91 (26), 13047-13051 (1994).
  5. Matsumoto, S., et al. Low-field paramagnetic resonance imaging of tumor oxygenation and glycolytic activity in mice. J. Clin. Invest. 118 (5), 1965-1973 (2008).
  6. Velan, S. S., Spencer, R. G. S., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Electron paramagnetic resonance oxygen mapping (EPROM): Direct visualization of oxygen concentration in tissue. Magn. Reson. Med. 43 (6), 804-809 (2000).
  7. Elas, M., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen image hypoxic fraction plus radiation dose strongly correlates with tumor cure in FSA fibrosarcomas. Int. J. Radiat. Oncol. 71 (2), 542-549 (2008).
  8. Dreher, M. R., et al. Nitroxide conjugate of a thermally responsive elastin-like polypeptide for noninvasive thermometry. Med. Phys. 31 (10), 2755-2762 (2004).
  9. Gallez, B., Mader, K., Swartz, H. M. Noninvasive measurement of the pH inside the gut by using pH-sensitive nitroxides. An in vivo EPR study. Magn. Reson. Med. 36 (5), 694-697 (1996).
  10. Halpern, H. J., et al. Diminished aqueous microviscosity of tumors in murine models measured with in vivo radiofrequency electron paramagnetic resonance. Cancer Res. 59 (22), 5836-5841 (1999).
  11. Elas, M., Ichikawa, K., Halpern, H. J. Oxidative Stress Imaging in Live Animals with Techniques Based on Electron Paramagnetic Resonance. Radiat. Res. 177 (4), 514-523 (2012).
  12. Kuppusamy, P., et al. Noninvasive imaging of tumor redox status and its modification by tissue glutathione levels. Cancer Res. 62 (1), 307-312 (2002).
  13. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev, Y. I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J. Biochem. Biophys. Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
  14. Plonka, P. M. Electron paramagnetic resonance as a unique tool or skin and hair research. Exp. Dermatol. 18, 472-484 (2009).
  15. Halevy, R., Shtirberg, L., Shklyar, M., Blank, A. Electron Spin Resonance Micro-Imaging of Live Species for Oxygen Mapping. J. Vis. Exp. (42), e122 (2010).
  16. Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Microimaging of oxygen concentration near live photosynthetic cells by electron spin resonance. Biophys J. 99 (3), 971-978 (2010).
  17. Eaton, G. R., Eaton, S. S. . Concepts Magn. Reson. 7, 49-67 (1995).
  18. Maltempo, M. M. Differentiaon of spectral and spatial components in EPR imaging using 2-D image reconstruction algorithms. J. Magn. Reson. 69, 156-161 (1986).
  19. Tseitlin, M., et al. New spectral-spatial imaging algorithm for full EPR spectra of multiline nitroxides and pH sensitive trityl radicals. J. Magn. Reson. 245, 150-155 (2014).
  20. Mitchell, D. G., Radu, N., Koch, S., et al. . Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 242, (2011).
  21. Stoner, J. W., et al. Direct-detected rapid-scan EPR at 250 MHz. J. Magn. Reson. 170 (1), 127-135 (2004).
  22. Tseytlin, M., Biller, J. R., Mitchell, D. G., Yu, Z., Quine, R. W., Rinard, G. A., Eaton, S. S., Eaton, G. R. . EPR Newsletter. 23, 8-9 (2014).
  23. Biller, J. R., et al. Imaging of nitroxides at 250 MHz using rapid-scan electron paramagnetic resonance. J. Magn. Reson. 242, 162-168 (2014).
  24. Biller, J. R., et al. Improved Sensitivity for Imaging Spin Trapped Hydroxyl Radical at 250 MHz. Chem. Phys. Chem. 16 (3), 528-531 (2015).
  25. Burks, S. R., Bakhshai, M. A., Makowsky, M. A., Muralidharan, S., Tsai, P., Rosen, G. M., Kao, J. Y. 2H, 15N-Substituted nitroxides as sensitive probes for electron paramagnetic resonance imaging. J. Org. Chem. 75, 6463-6467 (2010).
  26. Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Hadad, C. M., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Synthesis and characterization of amino derivatives of persistent trityl radicals as dual function pH and oxygen paramagnetic probes. J. Am. Chem. Soc. 130 (32), 10780-10787 (2008).
  27. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magn. Reson. Chem. 53 (4), 280-284 (2015).
  28. Elajaili, H., Biller, J. R., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y., Tseytlin, M., Buchanan, L. B., Rinard, G. A., Quine, R. W., McPeak, J., Shi, Y., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Imaging Disulfides at 250 MHz to Monitor Redox. J. Magn. Reson. , (2015).
  29. Tseitlin, M., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Deconvolution of sinusoidal rapid EPR scans. J. Magn. Reson. 208 (2), 279-283 (2011).
  30. Halpern, H. J., Peric, M., Nguyen, T. D., Spencer, D. P., Teicher, B. A., Lin, Y. J., Bowman, M. K. Selective isotopic labeling of a nitroxide spin label to enhance sensitivity for T2 oxymetry. J. Magn. Reson. 90, 40-51 (1990).
  31. Tsai, P., et al. Esters of 5-carboxyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A family of spin traps for superoxide. J. Org. Chem. 68 (20), 7811-7817 (2003).
  32. Biller, J. R., et al. Frequency dependence of electron spin relaxation times in aqueous solution for a nitronyl nitroxide radical and perdeuterated-tempone between 250 MHz and 34 GHz. J. Magn. Reson. 225, 52-57 (2012).
  33. Rosen, G. M., et al. Dendrimeric-containing nitronyl nitroxides as spin traps for nitric oxide: Ssynthesis, kinetic, and stability studies. Macromolecules. 36 (4), 1021-1027 (2003).
  34. Bobko, A. A., et al. Redox-sensitive mechanism of no scavenging by nitronyl nitroxides. Free Radical Biol. Med. 36 (2), 248-258 (2004).
  35. Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical. Free Radical Bio. Med. 45 (3), 312-320 (2008).
  36. Mitchell, D. G., et al. Use of Rapid-Scan EPR to Improve Detection Sensitivity for Spin-Trapped Radicals. Biophysical Journal. 105 (2), 338-342 (2013).
  37. Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Trityl radicals as persistent dual function pH and oxygen probes for in vivo electron paramagnetic resonance spectroscopy and imaging: Concept and experiment. J. Am. Chem. Soc. 129 (23), (2007).
  38. Biller, J. R., et al. Electron spin-lattice relaxation mechanisms of rapidly-tumbling nitroxide radicals. J. Magn. Reson. 236, 47-56 (2013).
  39. Redler, G., Barth, E. D., Bauer, K. S., Kao, J. P. Y., Rosen, G. M., Halpern, H. J. In vivo electron paramagnetic resonance imaging of differential tumor targeting using cis-3,4-di(acetoxymethoxycarbonyl)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl. Magn. Reson. Med. 71 (4), 1650-1656 (2013).

Tags

Rapid-scan EPR ImagingRSEPRIElectron Paramagnetic ResonanceOxygen ConcentrationPHRedox StatusSignaling MoleculesBiomedical ResearchKrebsforschungTumor EnvironmentContinuous Wave EPRRapid-scan Experimental ConditionsResonator BandwidthRapid-scan Coil DriverN-15 PDTBMPOHydrogen PeroxideUV Irradiation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Biller, J. R., Mitchell, D. G., Tseytlin, M., Elajaili, H., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo. J. Vis. Exp. (115), e54068, doi:10.3791/54068 (2016).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image