Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Zusammenfassung

Dieses aktuelle Protokoll verwendet Fluoreszenzreporter, In-vivo-Markierung und intravitale Bildgebungstechniken, um die Überwachung des dynamischen Prozesses des Neutrophilen-Primings bei lebenden Tieren zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im menschlichen Blutkreislauf und sind an Entzündungsstellen schnell rekrutiert. Priming ist ein kritisches Ereignis, das die phagozytischen Funktionalität von Neutrophilen erhöht. Obwohl umfangreiche Studien die Existenz und die Bedeutung der neutrophilen Priming während der Infektion und Verletzungen enthüllt haben, bedeutet , diesen Prozess der Visualisierung in vivo nicht erreichbar gewesen. Das Protokoll bereitgestellt wird, ermöglicht die Überwachung des dynamischen Prozesses der Neutrophilen in lebenden Tieren Priming durch drei Methoden kombinieren: 1) Signal DsRed reporter - verwendet als ein Maß für Priming 2) in vivo - Markierung von Neutrophilen - erreicht durch Injektion von Fluoreszenz-konjugiertem anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoklonaler Antikörper (mAb) und 3) intravital konfokale Bildgebung. Oxazolon-induzierte Mausohr Hautentzündung, geeignete Sedierung von Tieren, wiederholte Injektionen von anti-Ly6G mAb und zurück: Mehrere wichtige Schritte sind in diesem Protokoll beteiligtention der Fokusdrift während der Bildgebung. Obwohl einige Einschränkungen beobachtet, wie die Grenze der kontinuierlichen Bilderzeugungszeit (~ 8 h) in eine Maus und das Austreten von Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran aus den Blutgefäßen in der Entzündungszustand liefert dieses Protokoll ein Grundrahmen für die intravital Abbilden grundierten Neutrophilen Verhalten und Funktion, die zur Prüfung von anderen Immunzellen in der Maus Entzündungsmodellen leicht erweitert werden kann.

Einleitung

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden und kurzlebig Leukozyten im Umlauf. Sie sind schnell zu den Standorten der Infektion oder Verletzung rekrutiert, wo sie als professionelle Phagozyten durch Freisetzung von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffzwischenprodukte zusammen mit Granulat enthält , um antimikrobielle Peptide und Proteasen ¹ dienen. Während ihrer Rekrutierung, sind Neutrophile "grundiert" durch verschiedene Mittel , einschließlich mikrobielle Produkte, Lockstoffe, und inflammatorischen Zytokinen, was zu einer deutlich verbesserten Phagozyten Funktionalität bei der Ankunft an einem Ort der Entzündung ^2. Die Mechanismen von Ne....

Protokoll

Alle Tierversuche sind in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien und genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Toledo durchgeführt.

1. Phänotypisierung von Pil1-DsRed Mäuse

HINWEIS: Nachkommen werden von der Zucht heterozygot Pil1-DsRed Mäuse mit Wildtyp (WT) C57BL6 Mäuse erzeugt. Drei bis vier Wochen alte Welpen werden als bereit für die Phänotypisierung. Submandibular Blutung der Mäuse folgt einem festgelegten Protokoll mit geringfügigen Änderungen ^23.

1. Isolation von weißen Blutkörperchen aus dem Vollblut von Maus Pu....

Ergebnisse

Screening von Pil1-DsRed-Mäusen basiert auf der phänotypischen DsRed Fluoreszenzsignal durch ihre peripheren Blutleukozyten mittels Durchflusszytometrie durchgeführt produziert. LPS - Stimulation bekannt ist IL-1β - Produktion in myeloischen Zellen , einschließlich Neutrophile, Monozyten und dendritischen Zellen ^26-28 induzieren. Somit werden isolierte Leukozyten 4 h mit LPS inkubiert vor der Zytometrie Analyse fließen. Myeloischen Zellen für die Zirkulation auf Basis von Zell.......

Diskussion

Das Ziel dieser Studie ist es, eine Technologie zur Überwachung des Prozesses der Neutrophilen-Priming in lebenden Tieren zu entwickeln, die noch nicht von den derzeit verfügbaren Techniken erfüllt. Um dieses Ziel zu erreichen, drei etablierten Methoden durchgeführt werden : 1) Induktion von Hautentzündung in IL-1β Promotor getriebene DsRed Reportermäusen als Maß für die Grundierung, 2) in vivo - Markierung von Neutrophilen mit niedrigen Dosen von Fluoreszenz-konjugiertem anti-Ly6G mAb und 3) intravital konfoka.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Heparin-Natrium	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-540-31
ACK Lysingpuffer	Lonza	10-548E
Fötales Rinderserum	Sigma-Aldrich	F0926
Lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich	L4391
Ketaminhydrochlorid	Hospira	NDC 0409-2051-05
Xylazin	LLOYD Labor	NADA #139-236
Acepromazin	Boehringer Ingelheim	ANADA 200-361
Haarentfernungscreme	Kirche & Dwight
Aceton	Fisher Scientific	A16P4
Oxazolon	Sigma-Aldrich	E0753
Alexa Fluor 647 Anti-Maus Ly6G Antikörper	BioLegend	127610
U-100 Insulinspritze mit 28 G Nadel	BD	329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDa	Sigma-Aldrich	74817
Schmetterlingsinfusionsset (27 G Nadel)	BD	387312
FACSCalibur Zytometer	BD
CellQuest Pro Software	BD
Konfokales Mikroskop	Olympus	FV1000
Metamorph Software	Universal Imaging