células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tem a capacidade intrínseca de se diferenciar e se auto-organizam em padrões de tecidos distintos; embora isso exige a apresentação de gradientes ambientais espaciais. Apresentamos stencil micropatterning como um método simples e robusto para gerar gradientes bioquímicas e mecânicas para controlar os padrões de diferenciação HPSC.
Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.
As células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo células embrionárias estaminais (hESCs) e células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs), são amplamente explorados em medicina regenerativa, bem como modelagem experimental da organogénese normais e doentes devido ao seu potencial de diferenciação em linhagens celulares de todos três camadas germinativas 1,2. O destino de diferenciação de hPSCs são altamente sensíveis a factores ambientais locais que podem modular processos mecanotransdução autócrino ou parácrino de sinalização 1, bem como mediadas por sinais físicos 3-5. Micropatterning celular engloba um conjunto de técnicas que foram desenvolvidas para organizar espacialmente a geometria e a localização de uma população de células como um meio para controlar o micro-ambiente celular local, tais como as interacções célula-célula e 6 interacções célula-matriz 3. No contexto da hPSCs, micropatterning celular tem sido empregado para obter insights importantes sobre como nicho dependeráent sinalização autócrina modula hESC decisões pluripotência-diferenciação 7 e organização em primeiros padrões de diferenciação embrionárias 6. 2D e 3D hPSCs micropatterned têm sido utilizados para controlar o tamanho das colónias de padrões multicelulares, que por sua vez influenciam as decisões de diferenciação para as três camadas germinais 8,9. Temos empregue micropadrões HPSC multicelulares para modular o grau de célula-célula e as interacções célula-matriz dentro de uma colónia HPSC para sondar como integrina-E-caderina diafonia pode dar origem ao destino celular heterogeneidade 10. As manifestações dos relatórios acima abrir novos caminhos para a aplicação de micropadrões multicelulares de hPSCs como modelos experimentais para o rastreio toxicidade dos medicamentos para doenças do desenvolvimento 11, para estudar o efeito de fatores de crescimento e hormônios durante a tecido ou desenvolvimento de órgãos, e para desvendar a formação de padrões de tecido.
Uma miríade de micropatter celularning técnicas têm sido desenvolvidas como revisto por Falconnet et. . al 12, mas apenas um punhado, como micro-contacto imprimir 7,8,13, micropoços cultura 14,15, photopatterning 6 e microstencils 16 foram implementadas com sucesso com hPSCs. O desafio com hPSCs micropatterning reside na sua vulnerabilidade e uma exigência rigorosa de matrizes específicas extracelular (MEC) e as condições de crescimento para a fixação e sobrevivência celular. Para padrões 2D HPSC, impressão micro-contato é um dos métodos mais comuns de gerar micropadrões HPSC em cultura de tecido e vidro substratos 13. O método pode ser usado para padrão de ECM comum utilizado na cultura HPSC, incluindo matrizes de laminina e da membrana basal, tais como Matrigel. No entanto, isso requer tipicamente um processo de revestimento de duas etapas auxiliado por poli-D-lisina, e necessita de condições atmosféricas e humidade inertes específicos para fazer micropadrões ECM estáveis para hPSCs para anexar em 6,13. A principal consideração de cada método micropatterning é se o regime de modificação da superfície pode gerar padrões de ECM HPSC-adesivas na resolução geométrica desejada, minimizando a fixação das células inespecífica para as áreas circundantes.
Aqui, nós relatamos o uso de micropatterning estêncil como um método simples para gerar micropadrões HPSC sem etapas de modificação de superfície suplementar, antes da geração de padrões de ECM adesivas para hPSCs para anexar diante. O estêncil célula é composta por uma fina membrana, folha por exemplo, polidimetilsiloxano (PDMS), com micron de milímetro de tamanho orifícios lacrados em um substrato de cultura de células para conter fisicamente revestimentos ECM e hPSCs posteriormente semeadas. Como estêncil padronização funciona, restringindo fisicamente do local onde HPSC pode acessar e ligam directamente ao substrato subjacente ECM revestido, este método é compatível com vários substratos que podem suportar culturas HPSC. As únicas requirement é que a escolha do material da matriz pode formar uma vedação reversível com o substrato. Estes substratos incluem poliestireno convencional de cultura de tecidos (TCPS) 17, substratos conjugados de ligando 18, bem como substratos elastoméricos com rigidez ajustável (por exemplo., PDMS) 19. Este método também permite que o revestimento de ECM diferente, tais como vitronectina (ou proteína VTN), laminina e matrizes de membrana basal (por exemplo, Matrigel e Geltrax) para permitir a fixação e diferenciação de hPSCs adequada. configurações de ECM-substrato Portanto, podemos transferir otimizadas para uma linha específica para HPSC estêncil micropatterning para óptima de células-matriz de adesão, sobrevivência e diferenciação. Recentemente, um método semelhante foi também relatada para dirigir a diferenciação hepática por hESCs micropatterning usando poli (metacrilato de metilo) (PMMA) de matrizes de micro-estêncil 16.
stencils celular pode ser fabricado a partir de materiais diferentes, incluindo metals 20,21, poli (p-xilileno) polímeros 22,23, PMMA 16 e mais comumente, PDMS 24-28. Silicone e poli (p-xilileno) polímeros stencils exigem gravura directa dos furos de passagem com equipamento especializado 20-23, o que limita a sua acessibilidade aos utilizadores biológicos. PDMS matrizes podem ser fabricados por diferentes métodos, dependendo do tamanho funcionalidade requerida, que tipicamente varia de 3 uM a 2.000 uM 11,26-29. Se pequenas características são desejadas, folhas de stencil finos pode ser produzida por moldagem por prensa de pré-polímero de PDMS em um modelo de silício microfabricado contendo relevos dos micropadrões 28. Para recursos> 1.000 mm, um cortador de laser de CO 2 proporciona um método de custo fácil e baixo para cortar diretamente os padrões sobre uma folha de PDMS pré-fundido durante a fabricação stencil. A reciclagem dos stencils PDMS também os torna rentável para realizar uma série de experimentos com consistência suficiente.
<p class = "jove_content"> Aqui, apresentamos a metodologia detalhada para a fabricação de um estêncil PDMS com 1.000 mm características de corte a laser e à geração de micropadrões hESC. Estas células estaminais embrionárias humanas micropadrões foram usadas para modular o grau de integrina e E-caderina mediada aderências dentro de uma colónia coesa células estaminais embrionárias humanas, de modo a investigar a forma como a polarização espacial de adesão celular resultou na célula destino heterogeneidade 10.Fabricação de stencils micropatterning
micropatterning estêncil fornece um método ideal para gerar micropadrões HPSC para investigar mediada por nicho de padronização diferenciação. A principal vantagem de estêncil sobre outras técnicas de modelação micropatterning, tais como a impressão e microcontact photopatterning, é que ele não necessita de modificação da superfície, e podem ser aplicadas em substratos convencionais TCPS. Portanto, os meios d…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é apoiado por NUS Inicie concessão (R-397-000-192-133) e Fundo Gap ETPL (R-397-000-198-592). GS é um estudioso NUS Research. Autores gostariam de agradecer ao Dr. Jiangwa Xing por seu apoio técnico sobre micropatterning celular.
2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
60 mm petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 Cells into single cells |
Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
H9 Cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |