Eine effiziente Methode erhalten Sie Dedifferenzierte Fettzellen

Summary

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Abstract

Tissue Engineering und Zelltherapie vielversprechend klinisch. In dieser Hinsicht multipotenten Zellen wie mesenchymalen Stammzellen (MSCs), können therapeutisch, in naher Zukunft wieder herzustellen Funktion geschädigte Organe verwendet. Dennoch einige technische Probleme, einschließlich der hochinvasiven Verfahren von MSCs und die Ineffizienz rund um ihre Verstärkung zu isolieren, behindern gegenwärtig die möglichen klinischen Verwendung dieser therapeutischen Modalitäten. Hierin stellen wir eine hocheffiziente Methode zur Erzeugung von dedifferenzierten Fettzellen (DFAT), MSC-ähnlichen Zellen. Interessanterweise kann DFAT Zellen in verschiedene Zelltypen, einschließlich adipogenen, osteogenen, chondrogenen Zellen und differenzieren. Obwohl andere Gruppen zuvor verschiedene Verfahren zur Erzeugung von DFAT Zellen aus reifen Fettgewebe präsentiert haben, unsere Methode ermöglicht es uns, mehr DFAT Zellen effizient zu produzieren. In dieser Hinsicht zeigen wir, dass DFAT Kulturmedium (DCM), ergänzt mit 20% FBS,ist wirksamer DFAT Zellen bei der Erzeugung als DMEM, ergänzt mit 20% FBS. Zusätzlich können die Zellen durch DFAT unserem Zellkulturverfahren hergestellt in verschiedene Gewebetypen redifferenziert werden. Als solche ein sehr interessantes und nützliches Modell für die Untersuchung von Gewebe Dedifferenzierung dargestellt.

Introduction

Die Zelltherapie und Tissue Engineering sind heiße Themen auf dem Gebiet der regenerativen Medizin ^1-5. Während diese therapeutischen Modalitäten großes Versprechen halten, die derzeit einige technische Probleme, ihre klinische Anwendung behindern. In diesem Zusammenhang ist, wie bei der Erzeugung von iPS-Zellen, alle Therapien Tissue Engineering müssen Zellen frei von äußeren Gen Transduktionen produzieren, um die Sicherheit der Patienten zu gewährleisten. Dementsprechend waren wir die erste Gruppe erfolgreich menschliche DFAT Zellen produzieren ^6. Mehrere andere Arbeitsgruppen haben unsere Methode , da angenommen DFAT Zellen von Säugetieren ^7-9, weiter hervorheben , die Nützlichkeit unseres Modells zu generieren.

Im Laufe von mehreren Studien haben wir festgestellt, dass die Qualität der Zellkulturumgebung durch Einstellen des Inhalts des Zellmediums verändert werden. Diese Erkenntnis hat zu einer Erhöhung der Erfolgsrate von DFAT Zellproduktion geführt und Zellqualität verbessert; beide kritischen Faktoren ineffizient Zellen für zukünftige klinische Studien zu generieren. In dieser Hinsicht verbesserte einer DFAT Kulturmedium (DCM, ein Medium ähnliche Zellmedium stammen mesenchymalen, die rekombinantes humanes Insulin, Serumalbumin, L-Glutaminsäure, verschiedene Fettsäuren und Cholesterin enthält) und ein Verfahren zur DFAT Zellgeneration und Proliferation wurde entwickelt (weitere Informationen über den Inhalt von DCM ist auf Anfrage erhältlich). Mit dieser Methode hohe Qualität DFAT Zellen wurden mit der Fähigkeit, erzeugt in verschiedene Zelltypen, einschließlich adipogenen, osteogenen und chondrogenen Zellen zu differenzieren. Insgesamt verbessert diese validierten Zellkultur Protokoll, um die Qualität der DFAT Zellen und kann zur Verbesserung der klinischen Anwendung der Zelltherapie und Tissue Engineering sehr nützlich sein.

Protocol

Proben von menschlichem subkutanen Fettgewebes wurden von Patienten in der Chirurgie in der Abteilung für Plastische Chirurgie, Urologie, Kinderchirurgie und Orthopädische Chirurgie der Nihon Universität Itabashi Hospital (Tokyo, Japan) erhalten. Die Patienten gaben informierte Zustimmung geschrieben, und die Ethikkommission der Nihon University School of Medicine der Studie zugelassen. 1. Gewebepräparation Bringen Sie die Gewebeprobe aus dem Operationssaal zu Labor. …

Representative Results

In dieser Studie wurde das Verfahren und das Toolkit für DFAT Zellgeneration verbessert (Abbildung 1). Unser Verfahren ermöglicht es uns , DFAT Zellen sowohl mit DCM und DMEM – Medium , das 20% FBS (2A) zu erzeugen. Als solche verglichen wir die Effizienz von DCM und DMEM DFAT Zellen zu erzeugen. In dieser Hinsicht verbesserte DCM DFAT Zellproliferation durch drei Mal , wenn auf DMEM verglichen, unabhängig von der Anzahl von Adipozyten (…

Discussion

Ältere Adipozyten , die in vitro Dedifferenzierung, ein Verfahren bekannt , als Deckenkultur unterzogen werden , können zu einer primitiveren Phänotyp zurückkehren und proliferativen Fähigkeiten gewinnen. Diese Zellen werden als dedifferenzierte Fett (DFAT) -Zellen bezeichnet. Die multilineage Differenzierungspotential von DFAT Zellen wurde bewertet. Durchflusszytometrie Analyse und Genexpressionsanalyse ergab , dass DFAT Zellen im Vergleich zu ASCS ⁶ sehr homogen waren. In der Tat ist das Zello…

Materials

CSTI303-MSC medium	CSTI	87-671	This medium is defined as DCM in the text
PBS(-)	Wako	166-23555	It does not contain Mg2+ and Ca2+
DMEM medium	Gibco	11965-092
Fetal Bovine Serum	Sigma	172012
Collagenase type II	Sigma	C-6885
Scissors	Takasago Medical Industry Co., Ltd	TKZ-F2194-1
Shaker	TAITEC	Bioshaker V.BR-36
Falcon Cell Strainer 100um Yellow	CORNING LIFE SCIENCES	DL 352360
Falcon 12.5cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap	CORNING LIFE SCIENCES	353107
18G needle	NIPRO	02-002
20ml Syringe	NIPRO	08-753
Z Series Coulter Counter	BECKMAN COULTER	383550